Proteína PR-4 de pimenteira-do-reino (piper nigrum l.): expressão heteróloga em sistema bacteriano e avaliação funcional

Autor: SILVA, Diehgo Tuloza da
Přispěvatelé: SOUZA, Cláudia Regina Batista de
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2015
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFPA
Universidade Federal do Pará (UFPA)
instacron:UFPA
Popis: CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas Proteínas Relacionadas à Patogênese (PR) são induzidas em resposta ao ataque de patôgenos. Proteínas PR são agrupadas em 17 famílias, PR-1 a PR-17. Atividades antifúngicas e enzimáticas foram descritas para algumas dessas proteínas. Entre elas, a família PR-4 compõe as classes I e II de quitinases de plantas. Um clone de cDNA que codifica uma PR-4 da classe II, nomeada PnPR-4, foi isolado, em estudos anteriores, de Piper nigrum L. (pimenteira do reino). Esta é uma importante cultura para Brasil, principalmente no estado do Pará, no entanto sua produção tem diminuído devido à doença conhecida como podridão da raiz (Fusariose) causada pelo fungo Fusarium solani f. sp. Piperis. Neste trabalho, o cDNA da PnPR-4 foi usado para a produção da proteína recombinante, chamada de PnPR-4. O quadro de leitura aberta (ORF) da PnPR-4, foi amplificado por meio de ensaio de PCR e, em seguida a ORF foi ligada ao vetor de expressão pET-29(a) e introduzido, por eletroporação, em E. coli Rosetta (DE3). Nas células transformadas, a produção da proteína de interesse foi induzida por IPTG 1mM à 37°C por 5h. Após a produção, a atividade enzimática da proteina recombinante PnPR-4 foi avaliada pela detecção da atividade enzimática de quitinase em gel de poliacrilamida após eletroforese. A atividade foi avaliada em pH: 5.0 e pH:7.8 para demonstra a estabilidade da proteína recombinante. A massa molecular da PnPR-4 foi de 13.5 kDa, estando de acordo com outras PR-4 produzidas pelo sistema de expressão heterologa em sistema bacteriano. No ensaio de atividade enzimática, a PnPR-4 apresentou atividade quitinolitica, tanto em pH:5.0 ou pH:7.8. Esta é uma característica de chitinases de plantas, atividade em uma ampla faixa de pHs. Onde, a atividade ótima ocorre entre pH: 3.0 e 5.0. Na proteína recombianante, o pH ótimo foi 5.0, no entato ela teve atividade em pH 7.8, demonstrando a estabilidade da enzima. Estes resultados mostram que o sistema bacteriano de expressão heteróloga é eficaz para a produção da proteína recombinante PnPR-4, que é uma enzima com atividade quitinolitica e altamente estável. Assim, a PnPR-4 é uma nova enzima que pode ser usado em biotecnologia vegetal no combate contra fungos patogênicos da planta. Pathogenesis-related (PR) proteins are plant proteins that are induced in response to pathogen attack. PR proteins are grouped into 17 independent families, PR-1 to PR-17. Antifungal and enzymatic activities have been described for some of these proteins. Among them, the PR-4 family comprises class I and II of plant chitinases. cDNA clone that encode a PR-4 of the class II, designated as PnPR-4, was previously isolated, in others studies, from Piper nigrum L. (black pepper). This is an important crop for Brazil, mainly in Pará state, however its production has decreased because root rot (Fusariose) disease caused by fungus Fusarium solani f. sp. Piperis. In this study, PnPR-4 cDNA clone was used for production of the recombinant protein, named PnPR-4, by bacterial expression system. Open Read Frame (ORF) of the PnPR-4 protein, was amplified from the cDNA clone by PCR assays, then ORF was linked in the expression vector pET-29(a) and introduced, by eletroporation, into E. coli Rosetta (DE3). The production of target protein, in transformed cells, was induced by 1 mM IPTG, at 37°C for 5h. After production, enzymatic activity of recombinant PnPR-4 was evaluated by Detection of Chitinase Activity after Gel Electrophoresis Polyacrylamide. Activity was evaluated in pH: 5.0 and pH: 7.8 for showing the stability of the recombinant protein. Molecular mass of Recombinant protein, PnPR-4, was 13.5kDa, according with others PR-4 produced by heterologous expression in bacterial system. In assay of enzymatic activity, PnPR-4 presented chitinolytic activity, both in pH: 5.0 or 7.8. This is a characteristic of plant quitinases, activity in a broad range of pHs. Where, optimal activity occurs between pH: 3.0 and 5.0. For PnPR-4, the optimal pH was 5.0, however in pH: 7.8 the recombinant protein had activity, demonstrating the stability of enzyme. These results showing that bacterial system of heterologous expression is effective for production of the recombinant protein PnPR-4, that it is an enzyme with chitinolytic activity and highly stable. Thus, PnPR-4, is now, a new enzyme which can be used in plant biotechnology in the combat against plant's pathogenic fungi.
Databáze: OpenAIRE
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