Desenvolvimento de linhagens de células murinas knockout para o Gene Trp53 via crispr/cas9

Autor: Nogueira, Marina Bizerril
Přispěvatelé: Tavares, Kaio Cesar Simiano, Teixeira, Louhanna Pinheiro Rodrigues, Ribeiro, Ana Karoline da Costa, Martins, Leonardo Tondello
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2021
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UNIFOR
Universidade de Fortaleza (UNIFOR)
instacron:UNIFOR
Popis: Made available in DSpace on 2022-06-23T00:17:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2021-11-04 With the advancement of technologies, the use of genetic engineering has been an important tool in the discovery of specific therapies as an alternative treatment. The CRISPR/Cas9 system has acted as a facilitator in these studies by performing sitedirected mutations to identify the mechanism of action of substances and their respective targets in in vitro models. This work aimed to develop a platform for analysis and validation of the mechanism of action of drugs through knockout cell lines for the Trp53 gene via CRISPR/Cas9. To this end, we initially isolated mesenchymal stem cells (MSCs) from murine bone marrow, prepared CRISPR vectors for Trp53 knockout, transfected mesenchymal stem cells and N2a cells, and genotyped them by PCR to validate gene editing. Even with the isolation and initial culture occurring uneventfully and generating viable MSCs, after transfection, we did not observe growth and adhesion of these cells to the plates. In order to validate the designed CRISPRs, we chose to use an N2a cell line, which showed a 10% efficiency for the deletion of the engineered region of Trp53 after the clonal isolation of colonies. We conclude that it was possible to generate genetically modified cells with deletion of a specific DNA region using the CRISPR system. Further research is needed to evaluate the effect of synthetic compounds for the treatment of cancer in these cells, and may contribute in the future to the proposition of new therapies. Keywords: CRISPR/Cas9; Gene Editing; Mesenchymal Stem Cells; N2a; Tp53; Cancer; Com o avanço das tecnologias, o emprego da engenharia genética tem sido uma importante ferramenta na descoberta de terapias específicas como alternativa de tratamento. O sistema CRISPR/Cas9 tem agido como facilitador nesses estudos efetuando mutações sítio-dirigidas para identificar o mecanismo de ação de substâncias e seus respectivos alvos em modelos in vitro. Este trabalho objetivou desenvolver uma plataforma para análise e validação de mecanismo de ação de drogas através de linhagens de células knockout para o gene Trp53 via CRISPR/Cas9. Para isso, foi realizado inicialmente o isolamento de células tronco mesenquimais (CTM) da medula óssea de murinos, preparo de vetores CRISPR para knockout de Trp53, transfecção de células tronco mesenquimais e de células N2a e genotipagem por PCR para validação da edição gênica. Mesmo com o isolamento e cultivo inicial ocorrendo sem intercorrências e gerando CTM viáveis, após a transfecção, não observamos crescimento e adesão destas células às placas. Com objetivo de validar as CRISPRs desenhadas, optou-se por utilizar uma linhagem de células do tipo N2a, que apresentaram uma eficiência de 10% para a deleção da região projetada de Trp53 após o isolamento clonal de colônias. Conclui-se que foi possível gerar células geneticamente modificadas com deleção de uma região específica de DNA através do sistema CRISPR. Novas pesquisas são necessárias para a avaliação de efeito de compostos sintéticos para o tratamento do câncer nestas células, podendo contribuir futuramente para a proposição de novas terapias. Palavras-chave: CRISPR/Cas9; Edição Gênica; Células-Tronco Mesenquimais; N2a; Tp53; Câncer
Databáze: OpenAIRE
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