In vitro model of renal tubular epithelial barrier in the context of the diabetic nephropathy : effect of treatment with high glucose and fatty acids in MDCK cells

Autor: Canuto, Leandro Pereira, 1994
Přispěvatelé: Collares-Buzato, Carla Beatriz, 1965, Linardi, Alessandra, Kmit, Arthur, Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Rok vydání: 2018
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Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
Popis: Orientador: Carla Beatriz Collares Buzato Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A nefropatia diabética (ND) consiste numa das principais complicações da diabetes mellitus, sendo a principal causa da disfunção renal crônica. Isso acontece como resultado de diversas alterações morfofisiológicas dos diferentes segmentos do néfron, tendo como um dos fatores desecadeantes, o desequilíbrio nos níveis plasmáticos de glicose e lipídios no organismo dos pacientes diabéticos. Diversos estudos relacionam a ND com a disfunção da barreira de filtração glomerular, no entanto, estudos enfocando a repercussão de alterações na barreira epitelial tubular renal na nefropatia diabética são raros. Desse modo, o objetivo dessa Dissertação de Mestrado foi investigar o efeito in vitro do tratamento com altas concentrações de glicose e dos principais ácidos graxos plasmáticos (AGL) (a saber, o ácido palmítico (AP), o oleico (AO) e o linoleico (AL)) sobre a barreira epitelial paracelular tubular. Para isso, células MDCK foram expostas a diferentes concentrações de glicose (180 e 360 mg/dL) ou de ácidos graxos (200 ou 400 µM). A análise da função de barreira epitelial, nesse sistema in vitro, foi realizada utilizando parâmetros funcionais, tais como a medida de resistência elétrica transepitelial (RT), a medida do potencial de diluição ao manitol (MPD) e o fluxo paracelular do marcador Lucifer yellow (LY), e parâmetros bioquímicos/morfológicos, pelas técnicas de imunocitoquímica e Western Blot para avaliação da distribuição e conteúdo celular de proteínas juncionais (a saber, as claudinas 1, 2 e 3, a ocludina e a ZO-1). A exposição das células MDCK a altas concentrações de glicose induziu diminuição da RT associada com um aumento da seletividade paracelular a cátions (após 24h), revelada pelo ensaio de MPD, assim como aumento do fluxo paracelular de LY (após 72h), quando comparadas com as células do grupo controle (expostas a 100 mg/dL). As análises de imunocitoquímica indicaram diminuição do conteúdo juncional de claudinas-1 e 3, assim como aumento significativo do conteúdo juncional e celular de claudina-2 (particularmente no tratamento de 24h), além de alterações tempo-dependentes no conteúdo juncional de ocludina e ZO-1. Essas alterações foram independentes das alterações osmóticas provocadas pela glicose, como indicado pela exposição das células MDCK ao manitol, na mesma osmolalidade utilizada para a maior concentração de glicose testada. O aumento da osmolalidade teve efeito oposto ao da glicose. Desse modo, observou-se aumento significativo da RT (após 24 e 72h), além de aumento do conteúdo juncional e celular de claudina-1 e diminuição do conteúdo juncional e celular de claudina-2. Quanto aos AGL, tratamento com AP (AGL saturado) induziu diminuição significativa de RT e aumento do fluxo paracelular de LY. Esses resultados foram acompanhados pela diminuição do conteúdo juncional de claudina-1 e ZO-1, além de aumento do conteúdo juncional de claudina-2 e ocludina. A exposição das células MDCK ao AO (AGL monoinsaturado) não resultou em alteração significativa nos parâmetros funcionais analisados; no entanto, observou-se redução do conteúdo juncional de claudinas-1, -2 e -3, ocludina e ZO-1. O tratamento com o AL (AGL poliinsaturado), por sua vez, induziu aumento da RT, acompanhado por aumento do conteúdo juncional de claudinas-1, -3, ocludina e ZO-1, assim como diminuição do conteúdo juncional de claudina-2. A exposição aos ácidos graxos testados não resultou em alteração do conteúdo celular dessas proteínas. Em conclusão, os componentes que estão alterados em indivíduos diabéticos, tais como a glicose e os ácidos graxos livres (particularmente o AGL saturado), podem ser prejudiciais às células tubulares renais, provocando modificações significativas na estrutura e função da barreira paracelular tubular renal, que podem, por sua vez, ter repercussão no desenvolvimento e progressão da nefropatia diabética Abstract: Diabetic nephropathy (DN) is one of the main complications of diabetes mellitus, being the main cause of chronic renal dysfunction. ND is associated with several morphophysiological changes of the different segments of the nephron, having as triggering factors, the imbalance of the plasma levels of glucose and lipids in diabetic patients. Several works relate ND to glomerular filtration barrier dysfunction. However, studies focusing on the repercussion of changes in the renal tubular epithelial barrier in the context of ND are rare. Thus, the objective of this Master's Dissertation was to investigate the in vitro effect of acute (24h) and chronic (72h) treatment with high glucose concentrations and with the main plasmatic fatty acids (FFA) (namely palmitic acid (PA), oleic (OA) and linoleic acid (LA)) on the tubular paracellular epithelial barrier. For that, MDCK cells, a tubular epithelial cell line, were exposed to different concentrations of glucose (100, 180 and 360 mg/dL) or fatty acids (200 or 400 µM). The analysis of the epithelial barrier function in this in vitro system was performed using functional parameters, such as the measurement of transepithelial electrical resistance (TEER), the measurement of the potential for dilution to mannitol (MPD) and the paracellular flux of the marker Lucifer Yellow (LY), as well as biochemical/morphological parameters, by immunocytochemistry and Western Blot techniques to evaluate the distribution and cellular content of tight junctional (TJ) proteins (claudins-1, -2 and -3, occludin and ZO-1). Exposure of MDCK cells to high glucose concentrations induced a decrease in TEER associated with increased paracellular cation selectivity (after 24h) revealed by the MPD assay as well as increased paracellular LY flux (after 72h) when compared to the cells of the control group (exposed to 100 mg/dL). Immunocytochemical analyzes showed a decreased junctional content of claudins-1 and -3 as well as a significant increase in claudin-2 junctional and cellular content (particularly after 24-hour treatment), as well as time-dependent changes in the junctional content of occludin and ZO-1. These effects on the TJ-mediated epithelial barrier were independent of the osmotic changes caused by glucose, as indicated by exposure of MDCK cells to mannitol, at the same osmolality displayed by the highest glucose concentration tested. Indeed, the increase in osmolality had an opposite effect to that of glucose. Thus, a significant increase in TEER (after 24 and 72 hours) was observed associated with a significant increase of claudin-1 junctional and cellular contents and a decrease in claudin-2 junctional and cellular contents. Regarding the effects of FFA, PA treatment (a saturated FFA) induced a significant decrease of TEER and an increased paracellular LY flux. These results were accompanied by a decrease in the junctional content of claudin-1 and ZO-1, as well as an increase in the junctional content of claudin-2 and occludin. The exposure of MDCK cells to OA (a monounsaturated FFA) did not result in significant change in the functional parameters analyzed. However, a reduction of the junctional content of claudins-1, -2 and -3, occludin and ZO-1 was observed. Treatment with LA (a polyunsaturated FFA), in turn, induced an increase in TEER, accompanied by an increase in the junctional content of claudins-1, -3, occludin, ZO-1, as well as a decreased claudin-2 junctional content. Exposure to the fatty acids tested here did not result in alteration of the cellular content of these proteins. In conclusion, components that are altered in diabetic individuals, such as glucose and free fatty acids (particularly saturated FFA), may be harmful to renal tubular cells, causing significant modifications of the structure and function of the renal tubular paracellular barrier, which may, in turn, have repercussion on the development and progression of diabetic nephropathy Mestrado Biologia Tecidual Mestre em Biologia Celular e Estrutural CNPQ 131728/2016-4
Databáze: OpenAIRE
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