Papel das espécies reativas de oxigênio no desenvolvimento da resposta inflamatória na doença do enxerto contra hospedeiro induzida em camundongos

Autor: Priscila Teles de Toledo Bernardes
Přispěvatelé: Vanessa Pinho da Silva, Marina Gomes Miranda e Castor Romero, Caio Tavares Fagundes, Denise Carmona Cara Machado, Albená Nunes da Silva, Luana Pereira Antunes Dourado
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2016
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFMG
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
instacron:UFMG
Popis: Introdução: A doença do enxerto contra hospedeiro (graft versus host disease - GVHD) é uma doença secundária ao transplante de células hematopoiéticas (TCH), sendo a maior limitação desta terapia e ocorre quando linfócitos do doador tornam-se ativados em respostaaos antígenos do hospedeiro causando danos a vários órgãos, podendo levar à morte do paciente. Ela está associada à resposta inflamatória exacerbada com liberação de mediadores inflamatórios, tais como citocinas, quimiocinas e espécies reativas de oxigênio(ROS). No presente estudo avaliamos o papel de ROS na patogênese da GVHD. Métodos: A GVHD foi induzida pela transferência de 3x107 esplenócitos e de 1x107 células da medula óssea de camundongos doadores semialogênicos C57BL/6J-WT para camundongosB6D2F1 irradiados com dose de 9 Gy. Para avaliar o papel de ROS na GVHD, camundongos submetidos à doença foram tratados com apocinina (grupo APO), um inibidor da translocação intracelular de componentes citossólicos do complexo NADPH-oxidase, nadosagem de 3 mg/kg/dia por via intraperitoneal (i.p), iniciado 30 minutos antes do trasplante até o final do experimento. Camundongos que receberam esplenócitos + células medulares de camundongos singênicos (B6D2F1 para B6D2F1) não desenvolveram a doença econstituíram o grupo controle. Os níveis de ROS foram analisados no baço, medula óssea, fígado e intestino em duas fases do desenvolvimento da doença: início dos sinais clínicos e da mortalidade, aproximadamente 6 e 13 dias após o transplante, respectivamente. A resposta inflamatória foi avaliada por análise: do estresse oxidativo (mensuração de superóxido dismutase, catalase e peroxidação lipídica), de níveis de citocinas e quimiocinas, por ELISA, da quantificação indireta de macrófagos pela atividade da n-acetilglicosaminidase (NAG) e neutrófilos pela atividade da enzima mieloperoxidase (MPO), de parâmetros histopatológicos, do recrutamento, adesão e acúmulo de leucócitos através de microscopia intravital ou citometria de fluxo. A sobrevivência e os sinais clínicos foram acompanhados durante o desenvolvimento da doença. O efeito do enxerto em eliminar o tumor (GVT) também foi analisado. Resultados: Verificou-se maiores níveis de ROS no baço e medula óssea (início dos sinais) em camundongos com GVHD. No início da mortalidade este grupo apresentou aumento de ROS no baço e fígado. O tratamento com apocinina diminui os níveis de ROS nestes órgãos. Concomitantemente, verificou-se uma redução significativa de TBARS (substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico), bem como diminuição nos níveis de IFN-gama, TNF-alfa, IL-17, CCL2, CCL3, CCL5, acúmulo de macrófagos associados a menores parâmetros histopatológicos no fígado e no intestino em camundongos submetidos à GVHD tratados com apocinina. O bloqueio da NADPH-oxidase foi associado à diminuição do rolamento e adesão de leucócitos no intestino. Além disso, o tratamento com apocinina levou a um menor acúmulo de células T CD4 + e CD8+ e de macrófagos em órgãos analisados. Observou-se uma redução na mortalidade (70%) e uma menor incidência e severidade das pontuações clínicas da doença em camundongos com GVHD tratados com apocinina. Verificou-se ainda que a apocinina não alterou o efeito benéfico do GVT. Conclusão: Nossos resultados demonstraram que as ROS desempenhamum papel pró-inflamatório levando a uma amplificação e não resolução na GVHD e que a redução em seus níveis pode ser uma estratégia importante no controle desta patogenia. ntroduction: Graft-versus-host disease (GVHD) is the greatest complication limiting the clinical utility of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), in which lymphocytes of donors (graft) are activated in response to host antigen. This disease is associated with increased inflammatory response through the release of inflammatorymediators such as cytokines, chemokines and reactive oxygen species (ROS). Here, we evaluate the role of ROS in the GVHD pathogenesis. Methods: GVHD was induced by the transplant of 1x107 bone marrow cells + 3x107 splenocytes from C57BL/6 mice (GVHD group). The control group received isogenic cells from B6D2F1 mice. To assess the role ofROS in the pathogenesis of GVHD, mice subject to GVHD were treated with apocynin (APO group), an inhibitor of the intracellular translocation of cytosolic components of the NADPHoxidase complex, using 3mg/Kg every day. The levels of ROS were analyzed in spleen, bone marrow, liver and intestine following phases of development of clinical disease: onset of clinical disease (day 6) and mortality (day 13). The inflammatory response was assessed by analysis of oxidative stress (superoxide t dismutase, catalase and lipid peroxidation), the levels of cytokines and chemokines by ELISA, indirect quantification of macrophages by Nacetylglucosaminidase activity (NAG), histopathological parameters, recruitment, adhesion and accumulation of leukocytes by intravital microscopy or flow cytometry in the early mortality of GVHD. We also investigated the accumulation of inflammatory cells in lymphoidorgans by flow cytometry onset mortality. The survival and clinical score of disease were evaluated. Results: Levels of ROS were increased in target organs of GVHD mice and reduced in apocynin-treated mice at day 6 and spleen and bone marrow and at day 13 in the liver. We verified a reduction of TBARS, in levels of IFN-gamma, TNF-alpha, IL-17, CCL2,CCL3, CCL5, accumulation of macrophage associated a less histopathology parameters in liver and intestine of mice treated with apocynin. Mechanistically, pharmacological blockade of the NADPH-oxidase was associated with decreased rolling and adhesion of leukocytes to The mesenteric microcirculation, as assessed by intravital microscopy. Moreover, the experiments showed that apocynin-treatment reduced the CD4+, CD8+ cells and macrophage accumulation in organs. The pharmacological blockade of NADPH oxidase resulted inreduced mortality (70%) and less incidence and severity of clinical scores of GVHD. We also observed that the treatment with apocynin did not alter the beneficial effect of graft-versustumor Conclusion: Our study demonstrates that ROS plays an important role in mediating GVHD. We suggest that strategies aimed at blocking the ROS production should be evaluated further for their usefulness as an adjuvant treatment in patients undergoing bone marrow transplant.
Databáze: OpenAIRE
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