Resistance screening test of Aspergillus fumigatus isolates against amphotericin B and echinocandins and evaluation of antifungal combinations against resistant isolates

Autor: Beraquet, Caio Augusto Gualtieri, 1991
Přispěvatelé: Schreiber, Angélica Zaninelli, 1965, Loyola, Ana Beatriz Alkmim Teixeira, Miguel, Danilo Ciccone, Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2020
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
Popis: Orientador: Angelica Zaninelli Schreiber Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A Aspergilose Invasiva (AI) é uma doença de alta morbimortalidade causada por Aspergillus spp, tendo como principal agente etiológico o Aspergillus fumigatus, fungo filamentoso, hialino, saprofítico e cosmopolita. Diversos países têm reportado o isolamento de A. fumigatus resistentes aos antifúngicos azólicos, a principal classe utilizada para tratamento de AI. Nesta situação, as opções terapêuticas são anfotericina B e a associação desta ou de outros azólicos que não fluconazol a equinocandinas. Assim, a descrição do perfil de susceptibilidade de A. fumigatus é relevante e o estabelecimento de um teste de triagem de resistência frente a estas pode auxiliar na detecção de micro-organismos resistentes na rotina laboratorial. O objetivo geral deste estudo foi desenvolver um teste de triagem de resistência de isolados de A. fumigatus obtidos de amostras clínicas sequenciais de 45 pacientes tratados no Hospital de Clínicas ¿ UNICAMP (2014-2018) frente a anfotericina B, caspofungina e micafungina. Os objetivos específicos foram: confirmar a identificação morfológica de isolados de A. fumigatus por meio de técnicas moleculares; determinar a taxa de resultados falsos sensíveis e falsos resistentes do teste de triagem utilizando o teste de suscetibilidade por microdiluição em caldo como padrão ouro e calcular o Coeficiente de Interação Fracional (CIF) de combinações antifúngicas - voriconazol com equinocandinas e anfotericina B com equinocandinas - frente a isolados resistentes aos azólicos que não fluconazol, anfotericina B e equinocandinas. Foi realizada a identificação molecular de 318 isolados de Aspergillus spp, sendo 296 A. fumigatus. Foi realizado teste de susceptibilidade a antifúngicos para todos os isolados por meio de microdiluição em caldo e calculadas as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) e Concentrações Efetivas Mínimas (CEM) dos antifúngicos de interesse. A CIM foi de 0,25 ¿ 2 µg/mL para anfotericina B, a CEM foi de 0,12 ¿ 0,5 µg/mL para caspofungina e menor ou igual a 0,015 para micafungina. Foi desenvolvido teste de triagem de resistência utilizando infusão do antifúngico de interesse (anfotericina B, caspofungina ou micafungina) em meio Ágar Mueller Hinton e 81 isolados, incluindo Aspergillus spp. com características de resistência intrínseca a anfotericina B. O teste de triagem para anfotericina B apresentou 2,47% de resultados falsos resistentes e 1,23% de falsos sensíveis. No teste de triagem com equinocandinas, houve 100% de concordância com os valores obtidos de CEM no método de microdiluição em caldo, considerando todos os isolados sensíveis. Para análise das combinações de antifúngicos (voriconazol ou anfotericina B com equinocandinas), foram utilizados 3 isolados resistentes a azólicos (LIF 2444-6, LIF 2552-4.9 and LIF 2328), 1 cepa selvagem (LIF3104) e dois ATCCs (A flavus ATCC204304 e A. fumigatus ATCC204305) e o resultado encontrado foi de CIF indiferente em todas as combinações. Conclui-se que o teste de triagem de resistência para equinocandinas demonstrou potencial de uso em rotinas laboratoriais, enquanto o teste de triagem para anfotericina B ainda necessita de validação, uma vez que não há consenso quanto aos valores de CIM para se considerar um isolado como resistente. Quanto às interações antifúngicas, como não foram observadas interações antagônicas, justifica-se sua aplicação in vivo para tratamento de AI envolvendo micro-organismos resistentes Abstract: Invasive Aspergillosis (IA) is a high morbidity and mortality-rate disease caused by Aspergillus spp. The most common etiological agent of aspergillosis is Aspergillus fumigatus, which is a saprophytic and cosmopolite hyaline filamentous fungus. Several countries have been reporting A. fumigatus resistant to azole antifungals, which are the first-line therapy for IA. In these cases, the therapeutic options are amphotericin B monotherapy and drug combinations of azole with echinocandins or amphotericin B with echinocandins. Therefore, there is relevance in evaluating the antifungal drug susceptibility profile of A. fumigatus and the production of a resistance screening test can assist in the detection of resistant microorganisms in laboratory routines. The primary aim of this study was to develop a resistance screening test for A. fumigatus isolates obtained from serial samples from 45 patients of Hospital de Clinicas - UNICAMP from 2014-2018, against amphotericin B, caspofungin and micafungin. The secondary objectives were: to confirm the morphological identification of A. fumigatus by molecular methods, to determine the screening test¿s false resistance and false susceptibility rates using the broth microdilution susceptibility test as the gold standard and, for isolates that presented any resistance to amphotericin B, echinocandins or azoles except for fluconazol, to evaluate the Fractional Interaction Coefficient Index (FICi) of the combination of voriconazole with echinocandins and amphotericin B with echinocandins. A total of 296 A. fumigatus from a sample of 318 isolates were identified utilizing beta-tubulin sequencing. An antifungal susceptibility test was performed by the broth microdilution method for all isolates to detect antifungal resistance. The range of Minimal Inhibition Concentration was 0.25 ¿ 2 µg/m for AMB and the range of Minimal Effective Concentration was 0.12 ¿ 0.5 µg/mL for caspofungin and less or equal 0.015 for micafungin. The resistance screening test was developed by infusion of amphotericin B, capofungin and micafungin in Mueller Hinton Agar medium. For this test, 81 isolates were selected, including Aspergillus spp. with intrinsic resistance to amphotericin B. A 2.47 a % false resistance and 1.23% false susceptibility rates were observed in the amphotericin B screening test. In the echinocandin screening tests, 100% of results were in agreement with the Minimal Effective Concentration obtained by the broth microdilution method, classifying all isolates as susceptible. For the FICi assay, 3 azole-resistant isolates (LIF 2444-6, LIF 2552-4.9 and LIF 2328), 1 wild-type isolate (LIF3104) and 2 ATCCs (A flavus ATCC204304 e A. fumigatus ATCC204305) were utilized. All FICi presented indifferent interactions between voriconazol or amphotericin B with equinocandins. It is possible to conclude that the echinocandin resistance test has potential to be used in the laboratory routine and further studies need to be made to validate the amphotericin B resistance screening test, as the breakpoints for amphotericin B are still being discussed. Regarding the antifungal combinations, as no antagonist FICi index was observed, their application in vivo in the treatment of IA caused by resistant A. fumigatus can be justified Mestrado Patologia Clínica Mestre em Ciências CAPES 001; 02-P-4237/2020
Databáze: OpenAIRE
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