Investigando a entrada de pequenas moléculas em bactérias gram-negativas

Autor: Fanti, Rebeka, 1992
Přispěvatelé: Couñago, Rafael Lemos Miguez, Alvarez-Martinez, Cristina Elisa, Edwards, Aled, Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Rok vydání: 2020
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
Popis: Orientador: Rafael Lemos Miguez Couñago Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A maioria das pequenas moléculas, incluindo antibióticos, não conseguem ultrapassar o envelope celular bacteriano. Essa dificuldade representa um desafio para a descoberta de novas drogas contra patógenos bacterianos. Subjacente a este problema está a nossa atual incapacidade de prever quais as propriedades físico-químicas que permitem que compostos entrem e se acumulem em células bacterianas. Em contraste, as propriedades farmacocinéticas para a entrada e o acúmulo de pequenas moléculas em células humanas são bem compreendidas. Esse conhecimento foi obtido, em grande parte, através da utilização de ensaios que permitem estudar a entrada e o acúmulo de compostos em células humanas vivas e que estão facilmente ao alcance da comunidade de pesquisa. Infelizmente, os métodos atuais para avaliar o acúmulo de pequenas moléculas em bactérias não são compatíveis com a utilização de células vivas e o equipamento e a experiência necessários não estão prontamente disponíveis na grande maioria dos laboratórios de microbiologia. Em nossos estudos, desenvolvemos um novo ensaio, baseado na transferência de energia entre um doador bioluminescente e um aceptor, chamado BRET, como um meio de avaliar o engajamento de compostos e suas características de ligação com uma proteína-alvo em células bacterianas vivas. Primeiramente, o sinal de BRET foi obtido em células de Escherichia coli que expressam uma proteína-alvo (Diidrofolato redutase, EcoDHFR) fusionada a uma pequena e muito brilhante luciferase, a NanoLuc (doador de BRET) e na presença de um ligante fluorescente (aceptor de BRET), que é capaz de ligar-se reversivelmente à proteína-alvo em células vivas. As características de ligação de compostos foram avaliadas por sua capacidade entrar na célula, competir e deslocar o marcador fluorescente do sítio ativo da proteína-alvo, consequentemente interrompendo a transferência de energia entre o doador e o aceptor de BRET. Resultados semelhantes foram alcançados em Micobacterium abscessus. Uma vez bem estabelecido, validamos o ensaio em formato de alta vazão e testamos uma biblioteca de 175 inibidores de DHFR inicialmente desenvolvidos para M. tuberculosis e conseguimos identificar novos ligantes para DHFR e permeáveis em células de E. coli e M. abscessuss Abstract: Most small molecules, including antibiotics, cannot transpose the bacterial cell envelope. This difficulty poses a challenge for the discovery of new drugs against bacterial pathogens. Underlying this problem is our current inability to predict what types of physicochemical properties small molecules should display to permeate and accumulate within bacterial cells. By contrast, the pharmacokinetic properties of compounds required to accumulate in human cells are now well understood due to the wide availability of assays that can detect compound accumulation in living human cells and that are easily within reach of the research community. Unfortunately, current methods to assess small molecule accumulation in bacteria cannot be performed using living cells and the required equipment and expertise is not readily available in the vast majority of microbiology laboratories. Here we developed a novel assay, based on Bioluminesce Resonance Energy Transfer (BRET), as a means to assess compound engagement and binding characteristics with a known target in living bacterial cells. First, BRET was achieved in live Escherichia coli cells expressing a target protein (Dihydrofolate reductase, EcoDHFR) fused with the small and bright NanoLuc luciferase (BRET donor) and in the presence of a cell-permeable fluorescent tracer (BRET acceptor) which is capable of reversibly interacting with the target protein. The binding characteristics of a test compound are revealed by its ability to penetrate the cell-envelope, compete and dislodge the fluorescent tracer, consequently disrupting the energy transfer between the BRET donor and BRET acceptor. Later, similar results were achieved in Mycobacterium abscessus. Once well established, we validated the assay in a high-throughput format and tested a library of 175 DHFR inhibitors initially developed for M. tuberculosis DHFR and we were able to identify novel cell penetrant ligands for E. coli and M. abscessus DHFR Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CNPQ 130075/2020-5 CAPES 001
Databáze: OpenAIRE
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