Caracterização de interações entre proteínas constituintes de um complexo de iniciação da tradução do tipo eIF4F em formas sanguíneas de Trypanosoma brucei

Autor: SILVA, Renata Santana da
Přispěvatelé: MELO NETO, Osvaldo Pompílio de, MOURA, Danielle Maria Nascimento, FREIRE, Eden Ribeiro
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2019
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFPE
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
instacron:UFPE
Popis: CNPq Os tripanossomatídeos são protozoários patogênicos que se caracterizam pelo controle da sua expressão gênica ser pós-transcricional, o qual inclui eventos regulatórios durante a tradução dos mRNAs. Em geral, a tradução em eucariotos se inicia através do reconhecimento dos mRNAs por meio do complexo heterotrimérico eIF4F (eIF4A, eIF4G e eIF4E). Múltiplos homólogos dessas subunidades foram identificados em tripanossomatídeos, formando diferentes complexos do tipo eIF4F. Um desses é formado pelas proteínas EIF4E6/EIF4G5/EIF4G5-IP, porém sua função ainda não foi definida nem o modo de interação entre suas subunidades. Este trabalho buscou contribuir na caracterização destas três proteínas em células sanguíneas de Trypanosoma brucei, e mapear in vitro a interação entre as mesmas. Inicialmente verificou-se por western blot a expressão da EIF4G5 em ambas as fases do ciclo de vida do parasita. Linhagens de T. brucei expressando as proteínas EIF4G5 e EIF4G5- IP fusionadas ao tag PTP foram então obtidas e usadas em ensaios de coimunoprecipitação, técnica pela qual se pode confirmar a formação do complexo na fase sanguínea do parasita. Por fim, proteínas recombinantes foram avaliadas quanto a sua capacidade de interagir entre si em ensaios do tipo pull-down. Foram verificadas interações diretas do EIF4E6 tanto com EIF4G5 quanto EIF4G5-IP. Mutações nos aminoácidos EF91-92AA no EIF4G5 aboliu sua ligação ao EIF4E6, sugerindo ser este o sítio de interação entre essas proteínas. Esses resultados avançam no delineamento da estrutura e função do referido complexo nos tripanossomatídeos. Trypanosomatids are pathogenic protozoa that are characterized by the control of their post-transcriptional gene expression, which includes regulatory events during the translation of the mRNAs. In general, translation in eukaryotes begins with the recognition of the mRNAs through the heterotrimeric complex eIF4F (eIF4A, eIF4G and eIF4E). Multiple homologs of the eIF4F subunits were identified in trypanosomatids, forming different eIF4F complexes. One of these is formed by EIF4E6 / EIF4G5 / EIF4G5-IP proteins, but its function has not still been defined nor the mode of interaction between its subunits. This work aimed to contribute to the characterization of these three proteins in Trypanosoma brucei bloodstream cells, and to map in vitro the interaction between them. The expression of EIF4G5 in both phases of the parasite life cycle was initially verified by Western blot. T. brucei lineages expressing the EIF4G5 and EIF4G5-IP proteins fused to the PTP tag were then obtained and used in coimunoprecipitation assays where it was possible to confirm the formation of the complex in the bloodstream phase of the parasite life cycle. Finally, recombinant proteins were evaluated for their ability to interact with one another in pulldown assays. Direct interactions of EIF4E6 with both EIF4G5 and EIF4G5-IP were observed. Mutations in amino acids EF91-92AA in EIF4G5 abolished its binding to EIF4E6, suggesting that this is the site of interaction between these proteins. These results advance in defining the structure and function of the targeted complex in trypanosomatids.
Databáze: OpenAIRE
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