Padronização e aplicação de uma reação em cadeia da polimerase espécie-específica para diferenciação entre as espécies Ascaris lumbricoides e Ascaris suum

Autor: Talita Rodrigues dos Santos
Přispěvatelé: Elida Mara Leite Rabelo, Luis Fernando Viana Furtado, Felipe Bisaggio Pereira, Ricardo Nascimento Araujo
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2021
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFMG
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
instacron:UFMG
Popis: CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais Ascaris lumbricoides e A. suum são descritos como as espécies de Ascaris que infectam seres humanos e suínos, respectivamente. Estima-se que cerca de 447 milhões de pessoas estejam infectadas por A. lumbricoides, sendo predominantes em crianças residentes nos países em desenvolvimento, caracterizando um sério problema econômico e de saúde pública nos países afetados. No entanto, existe um número crescente de casos de ascaridíase humana, mesmo em países cujos índices para esta parasitose eram baixos ou mesmo nulos. Nessas localidades, os suínos têm sido incriminados como a principal fonte de infecção para humanos. Apesar das formas adultas de ambas as espécies apresentarem diferenças morfológicas sutis, a obtenção não é trivial. Além disso, os exames parasitológicos, comumente usados na prática clínica, são incapazes de diferenciar espécies de Ascaris a partir dos ovos encontrados nas fezes. Todavia, técnicas moleculares têm sido propostas para realizar tal diferenciação. Por conseguinte, o presente trabalho teve como objetivo a padronização e aplicação de um ensaio da Reação em cadeia da polimerase (PCR) espécie-específica, baseada na metodologia PCR alelo-específico (AS-PCR), tendo como alvo molecular o Espaço Transcrito Interno 1 (ITS-1) do DNA ribossomal para varredura e identificação das espécies A. lumbricoides e A. suum a partir do ovo. Os controles positivos foram sintetizados por meio de PCR convencional e clonagem para padronização da técnica e uso nas reações. Foram obtidas amostras de fezes positivas de 68 pacientes de sete estados brasileiros para identificação das espécies. Amostras de fezes de seis suínos de duas propriedades de Minas Gerais também foram utilizadas como forma de validação da técnica. Após os processos de recuperação e incubação dos ovos de Ascaris, o DNA de ovo único foi utilizado nas PCR espécie-específica. Após as reações, todas as amostras obtidas de humanos foram genotipadas como A. lumbricoides e todas as amostras obtidas de suínos foram genotipadas como A. suum. Uma porcentagem (2,9%) dessas amostras foram sequenciadas para validação da técnica. Os resultados encontrados foram condizentes com a literatura vigente, a qual demonstra que em regiões endêmicas os ciclos de transmissão são separados, apesar de ser assumida a presença de um fluxo gênico limitado entre as espécies. Dessa forma, a execução desse trabalho possibilitou a padronização de uma metodologia útil para o diagnóstico diferencial das espécies, contribuindo para a caracterização do real perfil epidemiológico da ascaridíase humana e suína no Brasil. Os dados aqui apresentados podem auxiliar na implementação de futuras estratégias de controle. Ascaris lumbricoides and A. suum are described as the species of Ascaris infecting humans and pigs, respectively. It is estimated that about 447 million people are infected with A. lumbricoides, being predominant in children living in developing countries, characterizing a serious economic and public health problem in the affected countries. However, there is an increasing number of cases of human ascariasis, even in countries whose rates for this parasitosis were low or even zero. In these locations, pigs have been blamed as the main source of infection for humans. Despite the adult forms of both species presenting subtle morphological differences, obtaining is not trivial. In addition, parasitological tests, commonly used in clinical practice, are unable to differentiate Ascaris species from the eggs found in the feces. However, molecular techniques have been proposed to carry out such differentiation. Therefore, the present study aimed to standardize and apply a species-specific polymerase chain reaction (PCR) assay, based on the allele-specific PCR (AS-PCR) methodology, with the Transcribed Internal Space as a molecular target 1 (ITS-1) of ribosomal DNA for scanning and identification of A. lumbricoides and A. suum species from the egg. The positive controls were synthesized by means of conventional PCR and cloning for standardization of the technique and use in reactions. Positive stool samples were obtained from 68 patients from seven Brazilian states to identify the species. Stool samples from six pigs from two farms in Minas Gerais were also used as a way of validating the technique. After the recovery and incubation processes of Ascaris eggs, single egg DNA was used in species-specific PCR. After the reactions, all samples obtained from humans were genotyped as A. lumbricoides and all samples obtained from pigs were genotyped as A. suum. A percentage (2.9%) of these samples were sequenced for validation of the technique. The results found were consistent with the current literature, which demonstrates that in endemic regions the transmission cycles are separated, although the presence of a limited gene flow between species is assumed. Thus, the execution of this work enabled the standardization of a useful methodology for the differential diagnosis of species, contributing to the characterization of the real epidemiological profile of human and swine ascariasis in Brazil. The data presented here can assist in the implementation of future control strategies.
Databáze: OpenAIRE
Externí odkaz: