Desarrollo de líneas celulares estables hek293 productoras de hIFN-γ
| Autor: | YOANNA GARCIA LOPEZ |
|---|---|
| Přispěvatelé: | ANGELICA MENESES ACOSTA |
| Jazyk: | Spanish; Castilian |
| Rok vydání: | 2020 |
| Předmět: | |
| Zdroj: | Universidad Autónoma del Estado de Morelos UAEM Repositorio Institucional de Acceso Abierto de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos |
| Popis: | RESUMEN Introducción: El Interferón gamma (tipo II) es una citocina pleiotrópica que regula diversas funciones biológicas. El IFN-γ recombinante se ha expresado en diferentes sistemas que presentan varias desventajas, siendo necesario buscar nuevas alternativas de expresión con mejor calidad y potencial terapéutico, por ejemplo, el uso de líneas celulares de mamíferos, ya que representa una herramienta atractiva para la sobreexpresión de proteínas recombinantes de manera estable. Objetivo: Desarrollar líneas celulares HEK293 que expresen de manera estable el Interferón gamma humano para obtener mayor producción en comparación con un sistema de expresión transitorio (Ad5/IFN-γ). Metodología: La construcción del vector plasmídico pcDNA3(+) se realizó con el inserto de IFN-γ proveniente del vector pVAX1/IFN-γ. Posteriormente, la bacteria E. coli DH5-α se transformó, amplificó y el plásmido se purificó y secuenció. Por otro lado, la línea celular HEK293 se creció en medio DMEM/F-12 al 10% de SFB y la transfección con el vector recombinante se realizó en placa de 6 pocillos. Los cultivos transfectados se mantuvieron y monitorearon para realizar la primera selección clonal a través del gen de resistencia a la neomicina, evaluando la viabilidad celular. Posteriormente, la segunda selección clonal se realizó mediante el método de dilución limitante y las clonas sobreproductoras de IFN-γ se expandieron, la expresión del IFN-γ se detectó por RT-PCR y Western Blot; y, se cuantificó por la técnica ELISA. Resultados: Se determinó que la construcción molecular pcDNA3+/IFN-γ se realizó correctamente ya que contiene la secuencia codificante del gen de Interferón gamma (fragmento ~520 pb); asimismo, la secuenciación y el análisis Blast mostraron una similitud del 100% con el gen IFN-γ humano. La caracterización celular mostró una tasa de crecimiento específica de 0.0234 h-1 y un tiempo de duplicación de 29.6 h. Asimismo, la curva de muerte con Geneticin® produjo una dosis letal de 550 μg/mL. El RT-PCR mostró que había transcripción para el gen IFN-γ humano en todas las clonas transfectadas (520 pb) y el análisis SDS-PAGE también mostró que el IFN-γ se encuentra glicosilado y es de tipo II secretándose al medio de cultivo (~20 kDa). Posteriormente, se observó que en la segunda selección clonal las células HEK293 individuales alcanzaron productividades de IFN-γ de 50 a 400 pg/mL. La caracterización celular de las clonas HEK293 productoras de IFN-γ produjo tiempos de duplicación de 36.86 y 34.83 h (clonas de alta producción), 37.87 h (clon de media producción) y 37.06 h (clon de baja producción) expresando aún la proteína de interés con los subsecuentes pases a excepción de la clona de baja producción. Finalmente, la adaptación a medios libres de suero y el proceso de congelación-descongelación mostró la estabilidad de la clona celular HEK293 recombinante ya que se mantiene a un pase #33 la expresión proteica y génica del IFN-γ. Conclusiones: El desarrollo de las líneas celulares HEK293 con expresión estable se realizó correctamente con el vector recombinante pcDNA3+/IFN-γ obteniendo una alta productividad de proteína de 2.6 ng/mL en comparación con un sistema de expresión transitorio (Ad5/IFN-γ, 0.019 ng/mL). Siendo las clonas estables a más de ~215 generaciones y 33 pases. ABSTRACT Introduction: Interferon gamma (type II) is a pleiotropic cytokine that regulates various biological functions. Recombinant IFN-γ has been expressed in different systems that have several disadvantages, and it is necessary to search for new expression alternatives with better quality and therapeutic potential, for example, the use of mammalian cell lines, since it represents an attractive tool for overexpression. of stably recombinant proteins. Objective: To develop HEK293 cell lines that stably express human Interferon gamma to obtain higher production compared to a transient expression system (Ad5/IFN-γ). Methodology: The construction of the plasmid vector pcDNA3(+) was performed with the IFN-γ insert from the vector pVAX1/IFN-γ. Subsequently, the E. coli DH5-α bacterium was transformed, amplified, and the plasmid was purified and sequenced. On the other hand, the HEK293 cell line was grown in DMEM/F-12 medium with 10% SFB and transfection with the recombinant vector was performed in a 6-well plate. Transfected cultures were maintained and monitored to perform the first clonal selection through the neomycin resistance gene, evaluating cell viability. Subsequently, the second clonal selection was performed using the limiting dilution method and the IFN-γ overproducing clones were expanded, IFN-γ expression was detected by RT-PCR and Western Blot; and, it was quantified by the ELISA technique. Results: It was determined that the pcDNA3+/IFN-γ molecular construction was carried out correctly since it contains the coding sequence for the Interferon gamma gene (fragment ~520 bp); likewise, sequencing and Blast analysis showed 100% similarity with the human IFN-γ gene. Cell characterization showed a specific growth rate of 0.0234 h-1 and a doubling time of 29.6 h. Likewise, the death curve with Geneticin® produced a lethal dose of 550 μg/mL. RT-PCR showed that there was transcription for the human IFN-γ gene in all transfected clones (520 bp) and SDS-PAGE analysis also showed that IFN-γ is glycosylated and is type II secreting into the culture medium (~20 kDa). Subsequently, it was observed that in the second clonal selection the individual HEK293 cells reached IFN-γ productivities of 50 to 400 pg/mL. The cellular characterization of the IFN-γ-producing clones HEK293 produced doubling times of 36.86 and 34.83 h (high production clones), 37.87 h (medium production clone) and 37.06 h (low production clone) still expressing the interest with subsequent passes except for the low production clone. Finally, adaptation to serum-free media and the freeze-thaw process showed the stability of the recombinant HEK293 cell clone since the protein and gene expression of IFN-γ is maintained at a #33 pass. Conclusions: The development of HEK293 cell lines with stable expression was carried out correctly with the recombinant vector pcDNA3+/IFN-γ obtaining a high protein productivity of 2.6 ng/mL compared to a transient expression system (Ad5/IFN-γ, 0.019 ng/mL). The clones being stable to more than ~215 generations and 33 passes. |
| Databáze: | OpenAIRE |
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