Standardization of methods for gene function studies in Pratylenchus brachyurus e characterization of PB6584.1 protein involved on parasitism

Autor: Rafael Bruno Guayato Nomura
Přispěvatelé: Francismar Corrêa Marcelino-Guimarães ., Laurival Antônio Vilas Bôas, Luana Mieko Darben
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2017
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEL
Universidade Estadual de Londrina (UEL)
instacron:UEL
Popis: Pratylenchus brachyurus é atualmente o segundo principal fitonematoide na cultura da soja no Brasil. Considerando que as atuais práticas agronômicas para o controle deste patógeno não tem alcançado êxito, o desenvolvimento de variedades resistentes se apresenta uma alternativa promissora. Atualmente, a metodologia de RNA interferente (RNAi) constitui uma importante ferramenta para o estudo funcional de genes em diferentes espécies. De maneira geral, estudos de RNAi em fitonematoides são conduzidos tanto in vitro, via soaking, como in vivo, através de plantas geneticamente modificadas para expressarem moleculas de RNA dupla fita (dsRNA). Recentemente,a adminstração das moléculas de dsRNA in planta, sem a necessidade de transformação genética, vem sendo testada em vários patossistemas. Esta é conhecida como Aplicação Ectópica (AE),e se baseia na absorção direta do dsRNA pela planta. Embora seu uso em estudos envolvendo fitonematoides ainda não tenha sido descrito, os resultados em insetos evidenciam seu potencial para utilização em outros organismos. O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial de utilização dessas metodologias (Soaking e AE) para o estudo de genes em P. brachyurus, em especial da proteína PB6584.1, potencialmente envolvida no estabelecimento da parasitismo. Inicialmente, o método de soaking foi avaliado, sendo utilizadas moléculas de dsRNA não complementares aos transcritos do nematoide como controle para os testes. A capacidade de ingestão das moléculas de dsRNA foi determinada pela incubação dos nematoides em solução contendo dsRNA, octopamina (neuroestimulante) e marcadores de ingestão (FITC e dsRNA ligado ao fluorocromo Cy-3). Após a incubação, foram observados sinais de fluorescência no estilete e glândula esofágica, indicando que os nematoides foram capazes de ingerir o dsRNA. Para a avaliação da metodologia de AE, foi realizada a absorção radicular de dsRNA-GFP em plantas de soja. Foram avaliados o transporte do dsRNA através do tecido vegetal, bem como sua estabilidade ao longo do tempo, sendo o dsRNA detectado após 60 dias da infecção. Esses resultados demonstram o potencial dessas metodologias para o estudo de genes nesse nematoide. Para a caracterização da proteína PB6584.1, foi avaliado o perfil de expressão do gene ao longo do ciclo infeccioso, indicando a ativação da transcrição do candidato já no tempo de 12h após a infecção. Adicionalmente, o efeito do silenciamento do gene foi avaliado por ambas as metodologias, medindo-se a capacidade de multiplicação dos nematoides em cilindros de cenoura, após o soaking, e em plantas de soja, via soaking e AE das moleculas de dsRNA no solo. Após 60dai, foi avaliado o fator de reprodução (FR) de cada planta, não sendo observada diferença significativa entre os tratamentos (controle e PB6584.1). As análises de expressão do gene candidato demonstraram a ocorrência de silenciamento gênico em ambos os métodos. Assim, mais estudos se fazem necessários visando o estabelecimento de um método baseado em RNAi, para o estudo funcional de genes em P. brachyurus. Pratylenchus brachyurus is the second most important plant-parasitic nematode in soybean crops in Brazil. As the current agronomic practices to control this pathogen have been shown unsuccessful and not worth, the development of resistant varieties is a promising alternative. Nowadays, the RNA interference mechanism constitutes an important tool for gene function studies among different species. Traditionally, RNAi-based studies in PPNs are performed by both, in vitro, by soaking and in planta, by genetic modified plants expressing dsRNA molecules approaches. Recently, non-transgenic dsRNA delivery, in planta, has been applied for many different plant pathogen and pests. Known as Ectopic Delivery (ED) of dsRNA molecules, The methodology is based on the root absorption of the dsRNA and no data about its application in PPNs studies is available. Studies involving ED in insects shows that they were able to uptake the root absorbed dsRNA by feeding and have their target gene silenced. It makes clear the potential of the method for application in other organisms. The aim of this study was to evaluate the potential of this non-transgenic methods (Soaking and ED) for gene function studies in P. brachyurus, specially in PB6584.1 protein, potentialy envolved in its parasitism. Initially soaking was performed using non-target dsRNA-GFP. The nematode?s ingestion ability was evaluated through P. brachyurus mixed stages incubation in a soaking solution in the presence of dsRNA, neurostimulant octopamine and fluorescent ingestion markers (FITC and Cy -3 labeled dsRNA). After incubation, fluorescence was observed in both stylet and esophageal glands, indicating that the soaked nematodes ingested the dsRNA. For in planta ectopic delivery, dsRNA root absorption was performed in soybean plants. We evaluated the transport of dsRNA through the plant tissues as well as its stability over the time being detected even after 60 days. These results demonstrate the potential of both methods for gene function studies in this nematode specie. For the PB6584.1 protein characterization, its expression profile during the infection cycle was evaluated indicating the protein transcription activation on 12h after infection. Aditionally, the effect of its silencing was evaluated for both methods, measuring the nematode?s multiplication capacity on carrot cylinders, after soaking, and on soybean plants, after soaking and dsRNA ED. After 60dpi, reproduction factor was measured in each plant, where no significant difference was observed between the treatments (control and PB6584.1). Also, the PB6584.1 expression was measured, demonstrating the occurrence of specific gene silencing in both methods. Thus, more studies are required for the stablishment of a RNAi-based method for gene funcion studies in P. brachyurus.
Databáze: OpenAIRE
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