An?lise do efeito do metabolito da an?lise do efeito do metabolito da microbiota acetato de s?dio frente a infec??o pelo v?rus SARS-COV-2 utilizando metodologia de Lamp

Autor: Reis, Tatiane Madeira
Přispěvatelé: Souza, Ana Paula Duarte de
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2022
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_RS
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS)
instacron:PUC_RS
Popis: A r?pida dissemina??o mundial da infec??o pelo v?rus da s?ndrome respirat?ria aguda grave (SARS-CoV-2) foi um desafio para a ci?ncia, at? que haja uma implementa??o efetiva do programa de vacina??o, uma estrat?gia robusta de testes, juntamente com medidas de preven??o, continuar? sendo a melhor escolha e mais vi?vel para o controle da propaga??o da doen?a, portanto verificou-se a necessidade de novos m?todos de detec??o. A microbiota intestinal tem como o produto ?cidos graxos de cadeia curta, um deles ? o acetato, ele protege camundongos contra a infec??o pela cepa VSR. No entanto, o papel do acetato na infec??o por SARS-CoV-2 ? desconhecido. Muitos m?todos para detec??o de ?cido ribonucleico SARSCoV-2 foram desenvolvidos. O padr?o-ouro para detec??o de RNA ? a PCR quantitativa de transcri??o reversa (RT-qPCR), exigindo equipamento especializado de disponibilidade limitada em muitos contextos. Por outro lado, existem t?cnicas que s?o cada vez mais apreciados como adequados para testes no local de atendimento, entre eles, o LAMP (amplifica??o isot?rmica mediada por loop) que devido ? sua simplicidade intr?nseca e alta sensibilidade possuem uma abordagem atraente. Portanto o estudo tem como objetivo: Testar os efeitos do acetato de s?dio no controle da infec??o pelo SARS-CoV-2 in vitro e analisar os resultados utilizando duas metodologias moleculares. A metodologia utilizada no estudo inclui: c?lulas foram pr? tratadas com 200 ?M ou 400 ?M de acetato por 24 h. As c?lulas foram infectadas com 0,1 multiplicidade de infec??o (MOI) de SARS-CoV-2 por mais 24 h ou 4 dias. As c?lulas foram colhidas para extra??o de RNA e s?ntese de cDNA e an?lise da express?o genica viral por PCR em tempo real. Para an?lise com outra metodologia molecular foi realizada a padroniza??o da metodologia de LAMP. Inicialmente foi feito a escolha da sequ?ncia dos iniciadores para dois genes de SARS-CoV-2. Os resultados foram confirmados atrav?s de gel de agarose, para a quantifica??o foi utilizado medidas de fluoresc?ncia em um espectrofot?metro. Os resultados mostraram que c?lulas pre-tratadas com acetato na concentra??o de 400 ?M apresentam menor positividade para SARS-CoV-2 amplificado por LAMP. Conclus?o: Nossos dados demonstram que ? poss?vel realizar um protocolo simples de LAMP para amplifica??o de genes do SARS-CoV-2. The rapid worldwide spread of severe acute respiratory syndrome virus (SARS-CoV-2) infection has been a challenge to science, until there is an effective implementation of a vaccination program, a robust testing strategy, together with prevention measures, will remain the best and most feasible choice for controlling the spread of the disease, so there was a need for new detection methods. The gut microbiota has short-chain fatty acids as its product, one of them is acetate, it protects mice against infection by the VSR strain. However, the role of acetate in SARS-CoV-2 infection is unknown. Many methods for detection of SARS-CoV-2 ribonucleic acid have been developed. The gold standard for RNA detection is reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR), requiring specialized equipment of limited availability in many settings. On the other hand, there are techniques that are increasingly appreciated as suitable for point-of-care testing, among them LAMP (loop-mediated isothermal amplification) which due to their intrinsic simplicity and high sensitivity have an attractive approach. Therefore the study aims to: Test the effects of sodium acetate in controlling SARSCoV-2 infection in vitro and analyze the results using two molecular methodologies. The methodology used in the study includes: cells were pre-treated with 200 ?M or 400 ?M acetate for 24 h. The cells were infected with 0.1 multiplicity of infection (MOI) of SARS-CoV-2 for another 24 h or 4 days. Cells were harvested for RNA extraction and cDNA synthesis and viral gene expression analysis by real-time PCR. For analysis with another molecular methodology the LAMP methodology was standardized. Initially, the primer sequence was chosen for two genes of SARS-CoV-2. The results were confirmed using an agarose gel, and for quantification, fluorescence measurements were used in a spectrophotometer. The results showed that cells pretreated with acetate at a concentration of 400 ?M show less positivity for LAMP-amplified SARS-CoV-2. Conclusion: Our data demonstrate that it is possible to perform a simple LAMP protocol for amplification of SARS-CoV-2 genes. Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES
Databáze: OpenAIRE
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