Dact1 gene expression in primary culture of chick myoblasts (Gallus gallus)

Autor: Contriciani, Renata Erbert, 1976
Přispěvatelé: Alvares, Lucia Elvira, 1968, Coutinho, Luiz Lehmann, Consonni, Sílvio Roberto, Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2018
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
Popis: Orientador: Lúcia Elvira Alvares Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A miogênese esquelética é o processo de formação da musculatura esquelética, que ocorre durante o desenvolvimento embrionário de cada indivíduo, assim como no crescimento e reparo do tecido muscular ao longo do período pós-natal. A cultura primária de mioblastos de galinha é uma cultura celular simples e é considerada um dos melhores modelos para estudo da miogênese in vitro. Isto porque os mioblastos coletados do embrião conseguem recapitular em poucos dias as fases básicas da miogênese in vivo, desde a proliferação à diferenciação terminal e contração das fibras musculares. Pelo conjunto de vantagens expostas, este sistema foi escolhido para realização dos ensaios deste estudo, os quais ocorreram ao longo dos cinco dias necessários para que as células da linhagem miogênica passem do estado proliferativo à diferenciação terminal para formar fibras musculares contráteis. O objetivo principal desta pesquisa foi investigar a expressão do gene Dact1 e da proteína correspondente (DACT1) durante a miogênese in vitro, dado seu papel como modulador dos sinais das vias de sinalização WNT/beta-catenina e WNT/PCP, necessários na miogênese esquelética de vertebrados. Para validar a cultura primária de mioblastos como um modelo para estudo da miogênese de aves, foram realizadas análises morfológicas e detecção dos padrões de expressão proteica (Miogenina e Desmina) e gênica (Dact1, Ciclina D1, MyoD e Miogenina) ao longo dos cinco dias da miogênese in vitro. Os resultados confirmaram a expressão de Dact1, conforme hipotetizada inicialmente, assim como revelaram a coerência da expressão dos marcadores avaliados com as etapas correspondentes da miogênese ao longo dos diferentes dias de cultura. Na etapa seguinte, a expressão de DACT1/Dact1 foi caracterizada por imunofluorescência e qRT-PCR nos cinco dias de miogênese em cultura. Estes ensaios revelaram que DACT1 é expressa no núcleo e citoplasma dos diferentes tipos celulares presentes na cultura primária (mioblastos, miotubos, miofibras jovens e maduras). Em conjunto com os ensaios de qRT-PCR, foi detectada indução da expressão de DACT1/Dact1 nos dias mais avançados da miogênese, quando ocorre a diferenciação terminal e maturação das fibras musculares. Finalmente, a análise de expressão gênica (RT-PCR e hibridação in situ) e proteica (imunofluorescência) no tecido peitoral de embriões de galinha no dia 11 de desenvolvimento confirmaram a expressão de Dact1/DACT1 in vivo. Em conjunto, os dados apresentados neste trabalho apontam para DACT1 como uma molécula envolvida nas diferentes etapas miogênese esquelética de aves, em particular as mais tardias, onde ocorre uma forte indução da sua atividade gênica e proteica. Estes resultados abrem a possibilidade de que Dact1 participe tanto da miogênese de outros vertebrados quanto em humanos, incluindo esta molécula no repertório de proteínas que podem estar envolvidas em processos de patologias musculares, envelhecimento e reparo do tecido muscular. Várias possibilidades de atuação de DACT1 foram levantadas na discussão deste trabalho, contudo estudos funcionais serão necessários para comprovar as hipóteses levantadas Abstract: Skeletal myogenesis is the process of skeletal muscle formation, which occurs in each individual during embryonic development as well as during growth and repair of the skeletal musculature along the postnatal period. The primary culture of chicken myoblasts is a simple system of cell culture and it is considered one of the best models to study myogenesis in vitro. This is because the myoblasts collected from the embryo recapitulate in a few days the different phases of the in vivo myogenesis, from proliferation to terminal differentiation and maturation of muscle fibers. For the set of advantages exposed, this system was chosen to carry out the assays of this study, which occurred during the five days needed for myoblasts to pass from the proliferative stage to the phase of terminal differentiation to generate contractile muscle fibers. The main goal of this research was to investigate the expression of the Dact1 gene and its corresponding protein (DACT1) during in vitro myogenesis, given its role as a modulator of WNT/beta-catenin and WNT/PCP signaling pathways required for of vertebrate skeletal myogenesis. In order to validate the primary culture of myoblasts as a model for the study of avian myogenesis, morphological analyses and detection of protein (Myogenin and Desmin) and gene (Dact1, Cyclin D1, MyoD and Myogenin) expression patterns were performed during the five days of in vitro myogenesis. The results confirmed the expression of Dact1, as initially hypothesized, as well as reveled the expression consistency of the evaluated markers during the myogenic process along the different days of cell culture. In the next step, DACT1/Dact1 expression was analyzed by immunofluorescence and qRT-PCR during the five days of cell culture differentiation. These assays revealed that DACT1 is expressed in the nucleus and cytoplasm of the different cell types present in the primary culture (myoblasts, myotubes, young and mature myofibers). Together with the qRT-PCR assays, the induction of DACT1/Dact1 expression was detected in the latter days of myogenesis, when terminal differentiation and maturation of muscle fibers occur. Finally, gene expression (RT-PCR and in situ hybridization) and protein (immunofluorescence) analysis in chick embryo breast tissue at day 11 of development confirmed DACT1/ Dact1 expression in vivo. Overall, the data presented in this work point to DACT1 as an important molecule for the different skeletal myogenic stages of birds, particularly the later ones, where a strong induction of Dact1 gene and protein activity occurs. These results open the possibility that Dact1 may participate in the myogenesis of other vertebrates as well in humans, including this molecule in the repertoire of proteins that may be involved in processes of muscle pathologies, aging and muscle tissue repair. Several possible actions of DACT1 were raised in the discussion of this work, however functional studies will be necessary to prove the formulated hypotheses Mestrado Biologia Tecidual Mestra em Biologia Celular e Estrutural CAPES
Databáze: OpenAIRE
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