De genes à fenótipos : um estudo de genômica funcional na Mosca-da-bicheira, Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae)
| Autor: | Paulo, Daniel Fernando, 1990 |
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| Přispěvatelé: | Azeredo-Espin, Ana Maria Lima de, 1955, Junqueira, Ana Carolina Martins, Brandão, Marcelo Mendes, Maria, Carla Cristina Judice, Cônsoli, Fernando Luis, Brito, Reinaldo Otávio Alvarenga Alves de, Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS |
| Rok vydání: | 2019 |
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| Zdroj: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) instacron:UNICAMP |
| Popis: | Orientadores: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin, Ana Carolina Martins Junqueira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Apesar da sua natureza destrutiva, insetos considerados pestes nos proporcionam uma oportunidade impar de investigar como a evolução opera para a emergência de novos comportamentos e a conquista de nichos ecológicos. Em especial, identificar as bases genéticas subjacentes a sua biologia parece ser a chave para revelar as rotas evolutivas que levaram à suas adaptações ecológicas. A mosca-da-bicheira, Cochliomyia hominivorax, é um modelo promissor para estudar essas questões em califorídeos (Diptera: Calliphoridae). Enquanto espécies filogeneticamente próximas preferencialmente depositam seus ovos em matéria orgânica em decomposição, C. hominivorax infesta e alimenta-se de tecidos vivos de vertebrados de sangue quente. Surpreendentemente, e em oposição a sua importância, estudos acerca das bases moleculares envolvidas na escolha por hospedeiros vivos em C. hominivorax têm sido amplamente negligenciados. A fim de superar essa barreira, neste trabalho desenvolvemos protocolos eficientes de mutagêneses e estabelecimento de mutantes da mosca-da-bicheira utilizando a ferramenta de edição genômica CRISPR/Cas9 (Capítulo 1). Mutações direcionadas foram introduzidas no gene yellow de C. hominivorax (ChY), resultando no fenótipo brown body (bwb), o qual permitiu avaliar eventos mutacionais induzidos por Cas9. Elevadas taxas mutagênicas foram alcançadas ao entregar altas concentrações de complexos pré-formados de Cas9-sgRNA em embriões da mosca-da-bicheira. Mutações também foram introduzidas em transformer (Chtra), um gene chave para o desenvolvimento feminino em califorídeos. Mutações em Chtra resultaram na masculinização de fêmeas de C. hominivorax, sugerindo que este gene poderá se tornar um potencial alvo em futuras estratégias de manejo baseados em genética nesta espécie. Sinalização e percepção parecem evoluir em sincronia para moldar os comportamentos mediados por quimiorrecepção. Assim como em outros insetos, a mosca-da-bicheira utiliza-se de odores para encontrar hospedeiros. Neste contexto, o olfato deve ter tido um papel fundamental na mudança de preferencia por hospedeiros na linhagem de C. hominivorax. Para testar essa hipótese, nós examinamos o Receptor Co-receptor Olfativo Orco na mosca-da-bicheira (Capítulo 2). Insetos detectam odores em ambientes complexos através da expressão de Receptores Olfativos (ORs) e Receptores Ionotrópicos (IRs). Orco é um co-receptor obrigatório para a função de todos ORs mas não para os IRs, permitindo com que comportamentos mediados pelo olfato possam ser estudados através da manipulação de um único gene. Orco em C. hominivorax (ChomOrco) é altamente conservado em Diptera, devido à forte pressões seletivas purificadoras. A expressão de ChomOrco é relacionada a diversos aspectos morfológicos e comportamentais da mosca-da-bicheira, sendo altamente representado nos apêndices olfativos da espécie. Uma linhagem mutante para ChomOrco foi gerada utilizando os métodos de CRISPR/Cas9 desenvolvidos anteriormente. Experimentos comportamentais revelaram que mutantes para ChomOrco não respondem aos odores associados aos comportamentos de busca por alimento e hospedeiros. Esses resultados sugerem que a via olfativa mediada pelos ORs está intimamente associada à escolha por hospedeiros, implicando que a evolução deve ter agido nestes genes para arquitetar a especificidade olfativa de C. hominivorax. Este estudo representa o início de uma investigação ainda maior que pretende desvendar as bases genéticas dessa extraordinária adaptação ecológica: De um organismo livre para um parasita obrigatório Abstract: Despite their destructive nature, insect pests provide us with an unparalleled opportunity to investigate how species evolve new behaviors and adapt to novel ecological niches. Especially, identifying the genetic bases underlying their lifestyle seems to be the key to unlock the evolutionary routes leading to their ecological adaptation. The New World Screwworm fly, Cochliomyia hominivorax (Coquerel, 1858), is a promising model for studying shifts in host-preference in blowflies (Diptera: Calliphoridae). While most closely related species lay their eggs on decaying organic matter, including carcasses, C. hominivorax oviposits on the dry borders of wounds and orifices of living warm-blooded vertebrates. Surprisingly, and in opposition to its associated economical and veterinary importance, the genetic basis of C. hominivorax¿s preference towards living hosts has largely been neglected. To overcome this constraint, we developed highly efficient protocols for mutagenesis and generation of Screwworm knockouts (KOs) using CRISPR/Cas9 genome editing (Chapter 1). Site-directed mutations were introduced in the C. hominivorax yellow gene (ChY), resulting in the brown body phenotype (bwb), a visual trait to score for Cas9-induced mutations. High rates of somatic and germline mutagenesis were achieved when delivering Cas9-sgRNA pre-assembled complexes at high concentrations into Screwworm embryos. We next targeted transformer (Chtra), a major gene required for normal female development in blowflies. Experiments resulted in the masculinization of C. hominivorax females (intersex XX flies), suggesting that Chtra is a potential target for future control strategies in this species. Due to these outcomes, we anticipate that CRISPR technology will have a tremendous implication for the implementation of new genetic-based strategies to manage this important insect pest. However, and most importantly, the data described here provide the foundation for functional investigations on the evolution of natural traits in C. hominivorax. Signaling and reception have been shown to evolve in synchrony to shape olfactory landscape, thus chemosensory-mediated behaviors, in many dipterans. Like in other insects, the Screwworm relies on volatiles (odors) to find suitable hosts for oviposition. Therefore, we hypothesized that olfaction may have played a critical role in the shift of niche-preference in the C. hominivorax lineage. To test this assumption, we functionally examined the Odorant Receptor Co-receptor gene (Orco) in Screwworm (Chapter 2). Insects detect odors through the expression of Odorant Receptors (ORs) and Ionotropic Receptors (IRs). Orco is an obligatory co-receptor for all ORs but not the IRs function, which in turn allows the screening of olfactory-mediated behaviors through the manipulation of a single gene. We found that C. hominivorax Orco (ChomOrco) is highly conserved within Diptera, as a consequence of a strong purifying selection regime. Expression of ChomOrco is linked to many morphological, developmental and behavioral aspects of the Screwworm, and is broadly represented in olfactory appendages of the adult flies. We next utilized this molecular information to knocking-out ChomOrco using the CRISPR/Cas9 methods previously described. Two-choice behavioral bioassays revealed that mutants for ChomOrco exhibit disrupted flight orientation, no longer responding to floral-like and host-associated volatiles. These results suggest that the OR-pathway is linked to host preference in Screwworm, and implies that evolution might have worked on the OR-pathway to architect the specific olfactory landscape in C. hominivorax. Overall, these results have several implications for functional investigations on blowflies, and will be a great addition to the current literature on Screwworm and other related blowflies. Yet, it is important to keep in mind that, the present study is just the beginning of a way longer investigation regarding the genetic basis of such extraordinary ecological adaptation: From a free-living to an obligatory parasitic fly Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2014/15042-3; 2017/05432-7 |
| Databáze: | OpenAIRE |
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