Estudo de proteínas induzidas por glicocorticoides: papel de GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper) e Anexina A1 na resolução da inflamação aguda

Autor: Juliana Priscila Vago da Silva
Přispěvatelé: Lirlândia Pires de Sousa, Ester Roffe Santiago, Sandra Helena Poliselli Farsky, Caio Tavares Fagundes, Gustavo Batista de Menezes
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2015
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFMG
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
instacron:UFMG
Popis: CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A resposta inflamatória é caracterizada pela liberação inicial de mediadores pró-inflamatórios e migração de leucócitos para o local da lesão em resposta a um estímulo estéril ou causado por patógenos. No entanto, a inflamação não controlada e persistente pode ser causa de doenças inflamatórias crônicas, sistêmicas ou autoimunes com eventual perda de função do órgão afetado, uma vez que proteases presentes nos grânulos dos neutrófilos podem perpetuar a inflamação por atuarem como agente flogístico. Desta forma, este processo deve ser finamente controlado pela ação de mediadores anti-inflamatórios e/ou pró-resolutivos e de anti-proteases endógenas que auxiliam na resolução do processo inflamatório e no retorno da homeostase tecidual. Nos últimos anos o estudo de agonistas da resolução, objetivando o encontro de moléculas que atuam na fase produtiva e resolutiva da inflamação, tem ganhado muita importância com as descobertas de moléculas pró-resolutivas lipídicas e proteicas. Dentre esses mediadores, destacam-se GILZ (glucocorticoid-induced leucine zipper) e anexina A1 (AnxA1), duas proteínas induzidas por glicocorticoides (GCs) que medeiam diversas funções desta classe de fármacos. Assim, o presente trabalho investigou a participação de GILZ e AnxA1, bem como o efeito de anti-proteases naturais e sintéticas, na resolução da resposta inflamatória aguda. Para tal, foi utilizado o modelo murino de pleurisia induzida por LPS em camundongos BALB/c. Após a injeção de LPS na cavidade pleural dos animais, as células presentes no lavado pleural foram coletadas em diferentes intervalos pósinjeção e analisadas. Foi observado um aumento da expressão de GILZ e AnxA1 durante a fase resolutiva da pleurisia, especialmente em macrófagos com fenótipos resolutivos. O tratamento profilático ou terapêutico de camundongos injetados com LPS com o peptídeo TAT-GILZ (permite a liberação de GILZ in vivo) melhorou os índices de resolução, diminuiu os níveis de citocinas e promoveu a apoptose de neutrófilos. O peptídeo TAT-GILZ também diminuiu a ativação/acúmulo das proteínas associadas com sobrevivência celular ERK1/2, NF-B e Mcl-1. Em camundongos deficientes em GILZ (GILZ-/-) a resolução da inflamação foi associada a um aumento precoce de AnxA1 sem modificação no influxo de neutrófilos induzida por LPS. Dexametasona (Dex) resolveu a inflamação induzindo a expressão de GILZ, cuja expressão foi dependente AnxA1. A resolução induzida por Dex não foi alterada em camundongos GILZ-/-, devido ao aumento compensatório da expressão de AnxA1. Estes resultados mostram que embora deficiência de GILZ seja compensado pelo aumento de AnxA1 a administração terapêutica de GILZ induz um programa pró-apoptótico eficaz em neutrófilos promovendo a resolução de inflamação neutrofílica induzida por LPS. Quanto ao estudo do balanço de proteases/anti-proteases, durante a cinética de resolução AnxA1 intacta foi detectada nas células desafiadas com PBS, e a sua clivagem foi máxima entre 8-24 horas após LPS, quando o recrutamento de neutrófilos e a expressão e a atividade de elastase foi máxima. A expressãõ de AnxA1 intacta assim como de anti-proteases endógenas (SLPI - secretory leukocyte protease inhibitor e Elafina) foi aumentada durante a fase resolutiva da inflamação. O tratamento de camundongos com SLPI e Elafina promoveu a resolução da inflamação associada com aumento de neutrófilos apoptóticos e aumento de AnxA1 intacta no interior da cavidade pleural. De maneira semelhante, o inibidor sintético de elastase, Sivelestat, promoveu a resolução da inflamação associada à prevenção de clivagem de AnxA1 e aumento da apoptose de neutrófilos dependente de caspases. De forma importante, Sivelestat aumentou o número de macrófagos com fenótipos resolutivos e a eferocitose de neutrófilos apoptóticos. A neutralização de AnxA1 utilizando um anticorpo neutralizante ou o bloqueio do seu receptor aboliu o efeito pró-resolutivo induzido por Sivelestat. Estes resultados mostram que a inibição de elastase por anti-proteases promove a resolução da inflamação associada com o aumento dos níveis de AnxA1 intacta e apoptose. Tomados em conjunto, estes dados mostram que proteínas induzidas por GCs ou estratégias terapêuticas que aumentam seus níveis podem se constituir em uma estratégia interessante para o controle de doenças inflamatórias The inflammatory response is characterized by the initial release of pro-inflammatory mediators and migration of leukocytes to the site of injury in response to sterile stimulus or caused by pathogens. However, persistent or uncontrolled inflammation may be cause of chronic inflammatory, systemic or autoimmune diseases with eventual loss of function of the affected organ, since proteases present in the granules of neutrophils can perpetuate inflammation by acting as phlogistic agent. Thus, this process must be finely controlled by the action of anti-inflammatory and/or pro-resolving mediators and endogenous anti-proteases that assist in resolution of the inflammatory process and the return of tissue homeostasis. In recent years the study of agonists of the resolution, aiming to find molecules that act in the production and termination phase of inflammation, has gained much importance to the findings of lipid and protein pro-resolving molecules. Among these mediators, are highlighted GILZ (glucocorticoid-induced leucine zipper) and annexin A1 (AnxA1), proteins induced by glucocorticoids (GCs) that mediate various functions of this class of drugs. The present study investigated the participation of GILZ and AnxA1, and the effect of natural and synthetic antiproteases in the resolution of the acute inflammatory response. For this purpose, it was used the murine model of LPS-induced pleurisy in BALB/c mice. Subsequently, the cells in the pleural fluid were collected at different post injection intervals and analyzed. It was observed that GILZ and AnxA1 expression was increased during the resolution phase of pleurisy, especially in macrophages with resolutive phenotypes. The prophylactic or therapeutic treatment of mice injected with LPS with the peptide TAT-GILZ (allows the in vivo delivery of GILZ), improved resolution indices, decreased cytokine levels, and promoted apoptosis of neutrophils. TAT-GILZ also decreased the activation/accumulation of the survival proteins ERK1/2, NF-B and Mcl-1. In deficient GILZ (GILZ-/-) mice the resolution of inflammation was associated with an early increase of AnxA1 without changing the influx of neutrophils induced by LPS. Dexamethasone (Dex) solved inflammation inducing GILZ expression, which was dependent of AnxA1. The resolution induced by Dex has not changed in GILZ-/- mice due to a compensatory increase AnxA1 expression. These results shows that despite GILZ deficiency are offset of AnxA1 increase, the therapeutic administration of GILZ effectively induces a pro-apoptotic program by promoting resolution of neutrophilic inflammation induced by LPS. As regards the study of the balance of protease/anti-protease during kinetic resolution, intact AnxA1 was detected in cells challenged with PBS, and its cleavage was maximal between 8-24 hours after LPS, when the recruitment of neutrophils and the expression and elastase activity was maximal. The AnxA1 expression as well as endogenous antiproteases expression (SLPI - secretory leukocyte protease inhibitor and Elafin) was increased during the resolution phase of inflammation. Treatment of mice with SLPI and Elafin promoted the resolution of inflammation associated with increased apoptotic neutrophils and intact AnxA1 in the pleural cavity. Similarly, the synthetic inhibitor of elastase Sivelestat, promoted the resolution of inflammation associated with prevention of AnxA1 cleavage and increased neutrophil apoptosis in a caspases dependent manner. Importantly, Sivelestat incresased the number of macrophages with resolutive phenotype and efferocytosis of apoptotic neutrophils. The AnxA1 neutralization using a neutralizing antibody or blocking its receptor abolished the effect induced by Sivelestat. These results show that inhibition of elastase by anti-proteases promote the resolution of inflammation associated with increased levels of intact AnxA1 and apoptosis. Taken together, these data show that proteins induced by GCs or therapeutic strategies which increases their levels may constitute an interesting strategy to the control of inflammatory diseases.
Databáze: OpenAIRE
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