Análise genômica e sequenciamento automático de rDNA em populações de fusarium oxysporum

Autor: Monteiro, Alana Sarmento
Přispěvatelé: Silva, Denise Maria Wanderlei, CPF:48567507472, SILVA, D. M. W., Ramalho Neto, Cicero Eduardo, CPF:21521808449, RAMALHO NETO, C. E., Lemos, Margarida Agostinho, CPF:1112343503, LEMOS, M. A., Amorim, Edna Peixoto da Rocha, CPF:17775949449, AMORIM, E. P. R.
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2004
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da Universidade Federal de Alagoas (UFAL)
Universidade Federal de Alagoas (UFAL)
instacron:UFAL
Popis: Fusarium oxysporum complex causes wilt disease in a wide variety of plants and are grouped into formae speciales based on their host range. Twenty-one isolates of the complex which represented F. oxysporum, f. sp. cubense, f. sp. lycopersici, f. sp. passiflorae, and f. sp. capsici were assessed for genetic diversity using RFLPs of the IGS region, RAPD-PCR, and DNA sequencing of ITS1- ITS2 and 5.8S rRNA gene. RAPD amplification with primer OPR5 generated 42 polymorphic bands and cluster analysis showed that the population is genetically heterogeneous. Comparison of the banding patterns both visually and by phenetic analysis suggests high level of genetic variation among the isolates and sub-divided them into six major groups. However, there was no correlation between RAPD-PCR banding pattern and f. spp. RFLPs produced by digestion with restriction endonucleases, BglI, SmaI, and SalI were used to further analyse the IGS region and identified several IGS haplotypes which did not differentiate among f. spp. Banding patterns and phenetic analysis generated do not showed clear separation among f. spp. and do not support separation based on host. DNA sequences of 5.8S rRNA gene and flanking intergenic transcribed spacers of several f. spp. from F. oxysporum were analyzed in order to detect molecular marker intraspecific for the f. spp. Primers ITS4/ITS5 showed good specificity for the species and yielded a unique fragment of approximately 550-570 bp. DNA bases determined in a Megabace1000 sequencer were further aligned and cladograms reconstructed with ClustalX (1.83) and Mega2 (2.1), respectively. ITS analysis grouped strains into several clusters based on NJ and UPGMA. The results suggested that the region could be used as a genetic marker to resolve relationships among f. spp. of F.oxysporum, however, it was too conserved for comparisons within a population of Foc. Overall, the ITS 2 was more variable than the ITS1 region and 5.8S rRNA gene was not parsimonicaly informative. Sequences of 18 isolates representing Fusarium oxysporum, including a human pathogenic one and another associated to trees, was chosen from GenBank and combined with our sequences. Phylogenetic reconstruction was not compatible with the separation of the species into f. spp. and agreed with previous reports of independent evolutionary origins within f. spp. Electronic diagnostic using Blastn could be used as a Bioinformatic tool identify Fusarium at genus level, only. Our results questioned the predicte value of the forma specialis naming system in the separation of different f. spp. in F.oxysporum complex and suggest the investigation of more reliable systems to identify the pathogen population. Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas O complexo Fusarium oxysporum é responsável por murchas em uma variedade de plantas e seus representantes são agrupados em formae speciales, de acordo com a sua patogenicidade a hospedeiros específicos. A diversidade genética de 21 isolados do complexo, representados por F. oxysporum, f. sp. cubense, f. sp. lycopersici, f. sp. passiflorae e f. sp. capsici, foi avaliada utilizando RFLPs da região IGS, RAPD-PCR e sequenciamento de DNA da região ITS1-ITS2 e do gene 5,8S rRNA. Amplificação RAPD com o iniciador OPR5 gerou 42 bandas polimórficas e a análise de agrupamento demonstrou que a população é geneticamente heterogênea. Comparações dos perfis genéticos gerados pelas análises visual e fenética sugerem um alto nível de variação genética entre os isolados, que foram sub-divididos em seis grupos principais. Entretanto, não houve correlação entre os perfis de banda RAPD-PCR e f. spp. Análise dos RFLPs, produzidos pela digestão com enzimas de restrição, BglI, SmaI e SalI da região IGS, identificou vários haplotipos. Perfis de bandas e análise fenética geradas não mostraram separação clara entre as f. spp. e não dá suporte à separação baseada em hospedeiros. Seqüências de DNA do gene 5,8S rRNA e da região espaçadora ITS de diversas f. spp. de F. oxysporum foram analisadas visando a detecção de um marcador molecular intraespecífico para as f. spp. Os iniciadores ITS4/ITS5 mostraram alta especificidade para a espécie e geraram uma banda única de aproximadamente 550-570 pb. Bases de DNA foram determinadas em um seqüenciador MegaBace1000, alinhadas com o programa ClustalX (1.83) e geraram cladogramas a partir do programa Mega2 (2.1), utilizando os métodos NJ e UPGMA, que agrupou os isolados em vários grupos. Os resultados sugerem que a região, apesar de pouco variável, poderia ser utilizada como um marcador molecular para resolver relações entre f. spp. de F. oxysporum. Entretanto, ela foi altamente conservada para comparações dentro da população de Foc estudada. Em geral, a região ITS2 foi mais variável que a ITS1 e o gene 5,8S rRNA não foi parsimonicamente informativo. Seqüências de 18 isolados representando F.oxysporum, inclusive de um isolado patogênico a humanos e de outro associado a árvores, foram selecionadas do GenBank e combinadas com nossas seqüências. Reconstrução filogenética também não foi compatível com a separação de espécies em f. spp. e concorda com relatos anteriores de origens evolucionárias independentes dentro das f. spp. O diagnóstico eletrônico através da ferramenta de Bioinformática blastn identificou Fusarium em nível de gênero. Os resultados questionam o valor preditivo do sistema denominado forma specialis dentro do complexo F. oxysporum e sugere a investigação de sistemas mais confiáveis para identificação de populações do patógeno.
Databáze: OpenAIRE
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