Caracterização in situ dos orientadores de axônio por repulsão (RGMs) na musculatura esquelética, e caracterização funcional do membro A (RGMa) durante a miogênese em camundongos

Autor: Aline Fagundes Martins
Přispěvatelé: Erika Cristina Jorge, Gregory Thomas Kitten, Gerluza Aparecida Borges Silva, Helio Chiarini Garcia, Chao Yun Irene Yan, Paulo Henrique A. Campos-junior
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2015
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFMG
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
instacron:UFMG
Popis: Orientadores de axônio por repulsão (RGMs) são moléculas que atuam como pistas negativas para orientar o crescimento axonal durante o desenvolvimento embrionário, permitindo a correta inervação dos tecidos e órgãos. A família RGM é composta por quatro membros: RGMa, RGMb, RGMc e RGMd. Novas evidências têm sugerido possíveis papéis para estas RGMs durante o desenvolvimento e manutenção da musculatura esquelética em vertebrados. RGMa e RGMb foram encontrados na região dos somitos onde se originam os precursores miogênicos e células satélites. Evidências também sugerem a presença dessas moléculas nas células musculares esqueléticas de camundongos adultos. No presente estudo, procuramos (1) determinar a localização de RGMa, RGMb e RGMc nas células musculares esqueléticas de camundongos adultos; e (2) investigar os efeitos da super-expressão e knockdown de RGMa nas células musculares esqueléticas in vitro. RGMa, RGMb e RGMc foram encontradas no sarcolema. RGMa também foi observada no sarcoplasma, onde apresentou um padrão estriado de marcação, semelhante às proteínas sarcoméricas. Foi possível co-localizar RGMa com proteínas sarcoplasmáticas conhecidas, sugerindo que este orientador de axônio atue como uma proteína sarcoplasmática. Ensaios de western blot revelaram a presença de dois peptídeos para RGMa em amostras de músculo esquelético adulto, um de 60 e outro de 33 kDa. A função biológica de RGMa em células musculares esqueléticas foi investigada em células da linhagem C2C12 e mioblastos primários. A super-expressão de RGMa in vitro promoveu o aparecimento de células mais largas, hipertróficas, em sua maioria miotubos; enquanto o knockdown de RGMa resultou em células menores, atróficas, com morfologia típica de mioblastos indiferenciados. O knockdown de RGMa bloqueou a formação de miotubos, uma vez que, interferiu na fusão dos mioblastos. Nossos resultados são os primeiros a mostrar uma molécula orientadora de axônio como uma proteína sarcoplasmática e a incluir RGMa nos sistemas que regulam o tamanho e a diferenciação da célula muscular esquelética in vitro. Repulsive Guidance Molecules (RGMs) are negative cues that, during development, guide axonal growth in order to allow the proper innervation of the tissues and organs. RGMs compose a family of four members comprised by: RGMa, RGMb, RGMc and RGMd. New evidence has suggested possible roles for RGMs during skeletal muscle development and maintenance in vertebrates. RGMa and RGMb were found in somites, specially in domains known to be the origin site of skeletal muscle pioneer and stem cells. Evidences also suggested the presence of these molecules in adult mice skeletal muscle cells. In the present study, we aimed to (1) determine the localization of RGMa, RGMb, and RGMc in adult mice skeletal muscle cells; and (2) investigate the effects of RGMa over-expression and knockdown in skeletal muscle cells in vitro. RGMa, RGMb e RGMc were found in the sarcolemma. RGMa was also observed in the sarcoplasm with a striated pattern of labeling similar to the sarcomeric proteins. We were able to colocalize RGMa and known sarcoplasmic proteins suggesting a role for this axon guidance molecule as a sarcoplamisc protein in skeletal muscle cells. Western blot analysis revealed the presence of two RGMa peptides in adult skeletal muscle samples, a 60 kDa and a 33 kDa fragment. RGMa phenotypes in skeletal muscle cells (C2C12 and primary myoblasts) were also investigated. RGMa over-expression produced larger, hypertrophic cells, mainly myotubes, whereas RGMa knockdown resulted in the appearance of athrophic cells, with a typical morphology of undifferentiated myoblasts. RGMa knockdown also blocked myotube formation in both skeletal muscle cell types since it interferes in myoblast fusion. Our results are the first to show an axon guidance molecule as a skeletal muscle sarcoplasmic protein and to include RGMa in a system that regulates skeletal muscle cell size and differentiation in vitro.
Databáze: OpenAIRE
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