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Die Produktion von Salicylsäure war das erste wegweisende Beispiel für eine großtechnische enzymatische Carboxylierung (Kolbe-Schmitt Reaktion), wobei jedoch harsche Bedingungen notwendig sind (90 bar, 120 300 C). Eine variierende ortho/para-Selektivität und ein unvollständiger Umsatz sind die Hauptprobleme dieses Prozesses. Im Gegensatz dazu findet die Biocarboxylierung von Aromaten mit verschiedenen Decarboxylasen regioselektiv unter milden Bedingungen statt. Damit ist das eine vielversprechende 'grüne' Alternative zur chemischen Methode. Ein Fokus dieses Projekts war die enzymatische ortho-Carboxylierung von aromatischen Substanzen mit ortho-Benzoic acid decarboxylasen. Das Erweitern der Substratbreite (z.B. Aromastoffe, Polyphenole) konnte man erfolgreich bewerkstelligen. Die Anwendbarkeit im größeren Maßstab konnte am Beispiel der Biocarboxylierung von Resveratrol gezeigt werden (95% Ausbeute). Bis jetzt wurde hauptsächlich Bicarbonat als CO2-Quelle verwendet, das in großen Mengen eingesetzt wird um das Gleichgewicht in Richtung der Carboxylierung zu verschieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, um CO2-Druckgas als CO2-Quelle für die biokatalytische Carboxylierungsreaktion zu nutzen, wodurch die Effizienz der biokatalytischen Carboxylierung verbessert und zugleich die Prozessoptimierung im großen Maßstab erleichtert wird. Eine Erweiterung der biokatalytischen (De)Carboxylierungs-Toolbox für heteroaromatischen Substrate durch die Verwendung von iso-Orotat decarboxylasen und 5-Carboxyvanillat decarboxylasen blieb bisher ohne Erfolg. Laufende Untersuchungen bezüglich struktureller und mechanistischer Aspekte können möglicherweise Aufschluss über das Ausbleiben der (De)Carboxylierungs-Aktivitäten an nicht-natürlichen Substraten erklären. Darüber hinaus haben wir uns auf Enzym-Kanditaten fokussiert, die 'nicht-phenolischen' Verbindungen umsetzen. Ferulic acid decarboxylasen gehören zur UbiD-Familie von Enzymen und katalysieren die reversible (De)Carboxylierung von Zimtsäure-Derivaten durch die Verwendung eines prenylierten Flavin-Cofaktors (prFMN). Die Enzyme besitzen eine umfassende Substratbreite für eine Vielzahl von Phenylacrylsäuren und heteroaromatischen Analoga davon, sowie für nicht-aromatische 2,4-Diensäuren. Versuche, die reversible Reaktion in die Carboxylierungsrichtung in der Gegenwart von Bicarbonat oder CO2-Gas durchzuführen, blieben ohne Erfolg. The production of salicylic acid was the first pioneering example of large-scale chemical CO2-fixation (Kolbe-Schmitt reaction), however the harsh reaction conditions (90 bar, 120 300 C), varying ortho/para-selectivity and incomplete yields are major issues of this process. In contrast, the enzymatic carboxylation of aromatic substrates catalyzed by various decarboxylases proceeds in a highly regioselective fashion under ambient conditions, thus representing a promising 'green' alternative to chemical methods. One focus of this work led on the enzymatic ortho-carboxylation of aromatic compounds by ortho-benzoic acid decarboxylases. The extension of the substrate scope towards complex compounds (e.g. flavoring agents, bioactive polyphenols) was successfully demonstrated and its applicability proven by the preparative scale biocarboxylation of resveratrol with 95% yield. So far, bicarbonate was used as main CO2-source, which needed to be applied in rather high amounts to drive the equilibrium towards carboxylation. During this thesis methods were established to use pressurized CO2 gas as carboxylating agent in order to improve the efficiency of biocatalytic carboxylations as well as facilitating process development on a large scale. Further expansion of the biocatalytic toolbox towards heteroaromatic compounds applying iso-orotate decarboxylase and 5-carboxyvanillate decarboxylase were not successful until now. Ongoing investigations on structural and mechanistic aspect might explain the lack of (de)carboxylation activities on non-natural substrates. Going beyond the (de)carboxylation of (hetero)aromatic compounds we searched for enzyme candidate acting on 'non-phenolic' substrates. Ferulic acid decarboxylases belong to the UbiD-family of enzymes and catalyze the reversible (de)carboxylation of cinnamic acid derivatives through the use of a prenylated flavin cofactor (prFMN). During this work we elucidated the substrate scope and high activity of three FDCs from various organisms. The enzymes displayed a broad substrate tolerance towards a variety of phenylacrylic acids and heteroaromatic analogs thereof, as well as non-aromatic 2,4-dienoic acids. However, attempts to reverse the reaction into the carboxylation direction in presence of bicarbonate or pressurized CO2 were unsuccessful so far. vorgelegt von Katharina Plasch, BSc MSc Zusammenfassungen in Deutsch und Englisch Karl-Franzens-Universität Graz, Dissertation, 2018 |
