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Wie in Studien von Gutmann und Nidetzky gezeigt wurde, kann die Entwicklung neuer C-Glykosylierungskatalysatoren aus bereits existierenden O-GTn hervorgehen. In derselben Studie wurde gezeigt, dass ein Austausch des Motivs im aktiven Zentrum eine bedeutsame Veränderung betreffend die Ausbildung der katalysierten glykosidischen Bindungsart zur Folge haben kann, nämlich den teilweisen oder vollständigen Umbau einer O-GT zu einer C-GT. Ziel der vorliegenden These war es, diese Strategie an zwei UDP-GTs zu wiederholen. Dazu wurde Asp 123/124 im aktiven Zentrum der pflanzl. UGT71A15 und UGT71K1 mit Ile ausgetauscht. Die rekombinanten Enzyme wurden anschl. in E. coli und S. cerevisiae exprimiert. Die Expession von UGT71A15_D123I in E. coli konnte beobachtet werden, C-glykosylierte. Produkte konnten nicht identifiziert werden. Trotz zahlreicher Expressionsrunden in INVSc1 und CEN-PK7d und der Proteinaufreinigung mit Streptag II, konnten die Enzymaktivitäten nicht signifikant beschrieben werden. Insgesamt geben die Ergebnisse einen Hinweis zur Annahme, dass die Expr. der ausgewählten Enzyme entweder durch die Mutationen selbst oder durch noch nicht identifizierte Probleme inhibiert wurde. Dennoch wurde die Wildtyp-O-GT-Aktivität der Enzymmutanten UGT71A15_D123I und UGT71K1_D124I in S. cerevisiae nachgewiesen. Obwohl der Aminosäureaustausch nicht zu Änderungen der Enzymaktivitäten führte, widersprechen die Ergebnisse nicht der oben erwähnten Studie, in der die Aktivitäten der hergestellten Enzymvarianten im Vergleich zu den Wildtyp-Aktivitäten um den Faktor 10^3 bis 10^4 reduziert waren. Folglich liegen die Ergebnisse dieser Arbeit im Erwartungsbereich. Berücksichtigt man die Resultate beider Studien gemeinsam mit der aktuell raschen Entwicklung im Bereich der C-GT Forschung,ist es wichtig festzuhalten, dass die Entwicklung neuer C-GTn aus bereits existierenden C-GTn ein erfolgsversprechenderer Ansatz für zukünftige Studien in diesem Forschungsfeld sein kann. It was shown by Gutmann and Nidetzky that effective development of new C-glycosylation catalysts can start from existing O-GTs . Previous mutants of OsC-GT and PcO-GT, involved in a partial or complete exchange of their activesite motif, showed a change in glycosidic bond-type formation. The objective of this thesis was to create new C-GTs by repeating this strategy via site directed mutagenesis in different O-GTs with highly similar motives in their active sites. For this purpose, the aa aspartate in the active site of the selected target enzymes UGT71A15 and UGT71K1 (O-GTs) was replaced with isoleucine. These enzymes were heterologously expr. in E. coli and S. cerevisiae. UGT71A15_D123I was well expr. in E. coli, but no C-GT-enzyme activity was detectable by HPLC. Expression in S. cerevisiae was too low to observe putative new C-GT-activity. Despite of multiple expr. rounds in two different strains, INVSc und CEN-PK7d, Strep-tag II-purification did not improve observability of the mutant enzymes' activities. Results lead to the assumption that functional expr. was disturbed or inhibited either by the introduced mutations themselves and/or other yet undefined expression or folding difficulties. Nevertheless, WT-enzyme activity of both mutants UGT71A15_D123I and UGT71K1_D124I was basically found to be present in S. cerevisiae. Even if the intended motive swap was not found to be altering enzyme activity in the expected manner, this thesis’ findings are not contradictive to the findings of Gutmann and Nidetzky. The catalytic activities of their created variant enzymes decreased 10^3 to 10^4 fold in comparison to the native enzymes. Consequently, this thesis outcome fits the spectrum of expected possible results. Taking into account the conclusions of both studies and the current rapid progress concerning C-GT research, it might be important to consider that the development of new C-GT candidates out of existing C-GTs may be a more feasible approach after all. Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft Abweichender Titel laut Übersetzung des Verfassers/der Verfasserin Masterarbeit Karl-Franzens-Universität Graz 2022 |
