| Popis: |
Amaç: Bu araştırma levreklerden izole edilen Vibrio türlerinin moleküler yöntemlerle identifikasyonunun yapılması ve antibiyotik dirençliliklerinin belirlenmesi amacı ile yapıldı. Gereç ve Yöntem: Araştırma, Mayıs-Eylül 2021 tarihleri arasında, Ege bölgesi balık çiftliklerinden alının 100 levrek örneği ile gerçekleştirilmiştir. Örneklerden elde edilen izolatlar fenotipik ve genotipik olarak identifiye edildikten sonra antibiyotik dirençliliği disk diffüzyon yöntemi ve antibiyotik direnç genlerinin multipleks PCR ile tespitiyle yapılmıştır. Bulgular: Araştırmada 100 levrek örneğinden konvansiyonel ve biyokimyasal yöntemle 46 (%46) Vibrio spp. izolatı elde edilmiştir. Elde edilen 46 izolatın16S rRNA PCR ile Vibrio spp. olduğu doğrulanmıştır. Multipleks PCR ile 22 (47,8) izolatın V. alginolyticus, 13 (%28,2) izolatın V. harveyi, 3 (%6,5) izolatın V. parahaemolyticus, 1 (%2) izolatın V. vulnificus, 7 (%15) izolatın Vibrio spp. olduğu belirlenmiştir. Antibiyogramda en yüksek direncin ampisiline (%84,8) karşı geliştiği belirlenirken tüm izolatların enrofloksasin ve sulfametoksazol-trimetoprime (%100) duyarlı olduğu tespit edilmiştir. İzolatlarda en yüksek direnç geninin trimetoprim direnç geni (%63), en düşük direnç geninin ise florokinolon direnç geni (%6,5) bulunmuştur. Sonuç: Bu çalışmada Vibrio türlerinin balık hastalıklarda primer erken olarak önemli bir rolü olduğu ve identifikasyonda moleküler yöntemlerin daha güvenilir sonuç verdiği, izolatlar arasında tekli ve çoklu antibiyotik direnci bulunduğu tespit edilmiştir. KABUL VE ONAY …………...………………………..…………….…………….. i TEŞEKKÜR ………………………………………………………….……………... ii İÇİNDEKİLER ..………………………………………….………...……….….…... iii ŞEKİLLER DİZİNİ ….………….………………………...……………….……….. vi RESİMLER DİZİNİ ….………….………………………...……………………….. vii TABLOLAR DİZİNİ ….………….……………………...…………………………. viii ÖZET ……………………………………………………………………………….. x ABSTRACT……………………………………………………………….……….... xi 1. GİRİŞ …………………….…………………...……………………….…….….... 1 2. GENEL BİLGİLER ……………………..………………………………....…….. 7 2.1. Vibriosis ……………………………………………………..…………………. 7 2.2. Antibiyotikler ve Direnç Mekanizmaları….….….…… ………………………... 11 2.2.1. Antibiyotik Direnç Genleri….….….…… ………………………..................... 15 2.3. Akuakültürde Antibiyotik Kullanımı ve Antibiyotik Direnci…………………… 19 3. GEREÇ VE YÖNTEM…………………………………………………………… 22 3.1. Gereç…………………………………………………………………………… 22 3.1.1. İzolasyon Örnekleri…………………………………………………………… 22 3.1.2. Kullanılan Besiyerleri, Solüsyonlar, Ayıraçlar……………………………….. 22 3.1.2.1. Kanlı Agar (Himedia®)……………………………………………………... 22 3.1.2.2. MacConkey Agar (Himedia®)……………………………………………... 23 3.1.2.3. Thiosulfate Citrate Bile Sucrose (TCBS) Agar (Himedia®)……………….. 23 3.1.2.4. Brain Heart İnfüzyon Broth (Himedia®)…………………………………… 24 3.1.2.5. Triptik Soy Agar (Himedia®)………………………………………………. 25 3.1.2.6. Mueller Hinton Medium (Himedia®)………………………………………. 25 3.1.2.7. Gram Boyama Kiti (Himedia®)……………………………………………. 26 3.1.2.8. 50X TAE (Tris, Asetik Asit, EDTA) Elektroforez Solüsyonu (Thermo Fisher Scientific®)…………………………………………………………………….. 26 3.1.2.9. 6X DNA Loading Dye (Thermo Fisher Scientific®)……………………….. 26 3.1.2.10. Tris/EDTA (TE) Buffer (Thermo Fisher Scientific®)…………………….. 27 3.1.2.11. Gel Loading Buffer (6X) (Thermo Fisher Scientific®)……………………. 27 3.1.2.12. NaCl (Himedia®)…………………………………………………………. 27 3.1.2.13. TE Buffer (10mM Tris+ 1mM EDTA) (Thermo Fisher Scientific®)……... 27 3.1.2.14. Katalaz Testi(Himedia®)………………………………………………….. 28 3.1.2.15. Oksidaz Testi (Oxoid ®)…………………………………………………… 28 3.1.2.16. Vibriostatik Ajan O/129 (Oxoid® DD14 ve DD15) Test Kiti ……………. 28 3.1.2.17. BD PhoenixTM ID Broth…………………………………………………… 28 3.1.2.18. BD PhoenixTM NMIC/ID-433……………………………………………... 29 3.1.2.19. BD PhoenixTM M50 Otomatize İdentifikasyon Sistemi…………………… 29 3.1.2.20. DNA Ekstraksiyon Kiti……………………………………………………. 29 3.1.2.21. ExPrime Taq Premix (2X) (GeNet Bio®)…………………………………. 30 3.1.2.22. Vibrio Türlerini Belirlemede Kullanılan Primerler……………………….. 30 3.1.2.23. Antibiyotik Direnç Genlerini Belirlemede Kullanılan Primerler…………. 31 3.1.2.24. Pozitif Kontroller………………………………………………………….. 31 3.1.2.25. Agaroz Jel…………………………………………………………………. 32 3.1.2.26. Marker…………………………………………………………………….. 32 3.1.2.27. Etidium Bromür (AppliChem®)…………………………………………… 32 3.1.2.28. Santrifüj Cihazı……………………………………………………………. 32 3.1.2.29. Termal Döngüleme Cihazı……………………………………………….... 32 3.1.2.30. Elektroforez Cihazı………………………………………………………... 33 3.1.2.31. Görüntüleme Cihazı……………………………………………………….. 33 3.2. Yöntem…………………………………………………………………………. 33 3.2.1. Fenotipik İzolasyon ve İdentifikasyon………………………………………... 33 3.2.2. Bakteriyel İzolatların BD Phoenix™ ile İdentifikasyonu…………………….. 34 3.2.3. Genotipik İdentifikasyon……………………………………………………... 34 3.2.3.1. DNA İzolasyonu……………………………………………………………. 34 3.2.3.2. DNA İzolasyonu Kit Prosedürü…………………………………………….. 34 3.2.3.3. PCR Analizi………………………………………………………………… 36 3.2.3.4. Elektroforez İşlemi…………………………………………………………. 36 3.2.4. Antibiyotik Duyarlılık Testleri……………………………………………….. 37 3.2.4.1. Kirby Bauer Disk Diffüzyon………………………………………………... 37 3.2.4.2. Multipleks PCR ile Antibiyotik Direnç Genlerinin Belirlenmesi ………….. 38 4. BULGULAR……………………………………………………………………… 39 4.1. Fenotipik İzolasyon ve İdentifikasyon Bulguları……………………………….. 39 4.2. BD Phoenix™ M50 İdentifikasyon Bulguları………………………………….. 39 4.3. PCR Analizi Bulguları………………………………………………………….. 40 4.3.1. Vibrio spp. 16S rRNA PCR Analizi Bulguları……………………………….. 40 4.3.2. Multipleks PCR Analizi Bulguları……………………………………………. 40 4.4. Antibiyotik Direnç Bulguları…………………………………………………… 45 4.4.1. Antibiyogram ………………………………………………………………… 45 4.4.2. Antibiyotik Direnç Genleri Sonuçları ………………………………………... 54 5. TARTIŞMA………………………………………………………………………. 62 6. SONUÇ VE ÖNERİLER…………………………………………………………. 71 KAYNAKLAR ..………………………………...……...……………………….….. 72 BİLİMSEL ETİK BEYANI ………………………………………………………… 91 ÖZ GEÇMİŞ …………………………………………...…………………………… 92 |
