Recherche de protéines issues de variants d’épissage de la 12-Lipoxygénase ovineChoix, conception et utilisation de vecteurs d’expression pour la production de protéines recombinantes

Autor: Dubois, Olivier
Přispěvatelé: Biologie du Développement et Reproduction (BDR), École nationale vétérinaire d'Alfort (ENVA)-Institut National de la Recherche Agronomique (INRA)
Jazyk: francouzština
Rok vydání: 2016
Předmět:
Zdroj: Sciences du Vivant [q-bio]. 2016
Popis: Une meilleure compréhension de la reproduction des animaux domestiques dépend d'unebonne connaissance du trafic moléculaire existant entre les tissus maternels utérins et leconceptus. Des molécules complexes sont impliquées dans les interactions embryo-maternelles,parmi lesquelles des protéines et des médiateurs lipidiques jouent un rôleimportant pour l'implantation et le développement de l'embryon. Chez certaines espèces, desmédiateurs lipidiques dérivés des lysophospholipides et des éicosanoïdes ont été décritscomme acteurs impliqués dans ces processus biologiques. Chez les ruminants, l'endomètresynthétise de nombreux métabolites cyclooxygénés dérivés de l'acide arachidonique (AA),un acide gras polyinsaturé, issus des phospholipides membranaires de la cellule. L'AA peutégalement suivre d'autres voies métaboliques telles celle des Epoxygénases P450 ouencore celle des Lipoxygénases (LOX). Les travaux préliminaires au sein de notrelaboratoire ont montré que l'endomètre ovin produit de grandes quantités de 12-S-HETE,suggérant l'implication de la 12-S-Lipoxygénase. Le rôle de cet enzyme dans le tractusreproducteur femelle est encore incompris alors qu'il a été clairement décrit dans desprocessus de prolifération cellulaire et des pathologies telles le cancer. L'objectif de ce travaila été de déterminer la capacité de l'utérus de brebis à produire des métabolites lipoxygénés,examiner l'expression de cet enzyme au niveau des transcrits et analyser la régulationgénique de la 12-S-Lipoxygénase pendant le cycle oestral et en début de gestation. Nousavons pu mettre en évidence, pour la première fois, la capacité de l'endomètre à produireune grande quantité de transcrits spécifiques de la 12-S-Lipoxygénase de type plaquettaire.Nous avons caractérisé un ARNm correspondant au gène ALOX12 ainsi qu'une forme issued'épissage alternatif, au dernier exon manquant. Ce variant n'est exprimé qu'au cours del'élongation et pendant l'implantation du conceptus alors que le transcrit correspondant à laforme "normale" est présent pendant toute la durée du cycle oestral et sur toute la périodepéri-implantatoire. Le clonage en vecteurs d'expression eucaryote pCMVß et la transfectionen lignée de cellules COS-7 a permis la production des protéines correspondantes in vitro.L'activité biologique de ces deux protéines a été évaluée par un test de conversion de l'AAen 12-S-HETE, mesuré par HPLC. L'activité biologique de la protéine correspondant à laforme épissée du transcrit reste inexistante par comparaison à la forme "normale". Enrevanche, le test d'activité réalisé en présence des deux protéines recombinantes, parcompétition vis-à-vis du substrat, révèle une diminution de l'activité de la 12-S-Lipoxygénasede forme "normale", suggérant un possible rôle régulateur de la forme courte sur la forme"normale". La cinétique d'expression de la protéine 12-S-Lipoxygénase dans l'endomètre aété évaluée sur les mêmes périodes d'étude grâce à l'utilisation d'un anti-peptide, spécifiquede chaque forme, fabriqué au laboratoire. L'anti-peptide correspondant à la forme courte n'apas permis la détection de celle-ci au sein de l'utérus. Cette forme existe-t-elle réellement invivo? Des investigations supplémentaires restent à poursuivre pour sa mise en évidence etle rôle de la 12-S-Lipoxygénase quant au développement et l'implantation de l'embryon chezla brebis.
Databáze: OpenAIRE
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