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NFAT (Nuclear factor of activated T cells) transcription factors play important physiological roles in the development and function of many organs, notably in the immune system and nervous system. As a consequence, their dysregulation has been implicated in various human diseases such as cancer, neurodegenerative diseases, and auto-immune diseases. The regulation of NFAT activity by calcium-dependent nuclear-cytoplasmic shuttling has been extensively studied. In contrast, the regulation of NFAT protein level by the ubiquitin-proteasome system is still poorly understood. However, NFATs are short-lived proteins and regulation of their stability is critical for controlling their activity.In a previous study, my group has shown that the E3 ubiquitin-ligase Trim17 binds NFATc3 but does not promote its ubiquitination and rather stabilizes it. Preliminary results suggested that Trim39, a partner of Trim17, might be an E3 ubiquitin-ligase for NFATc3 and that SUMOylation of NFATc3 might modulate its stability. Therefore, the goal of my PhD was to understand the mechanisms through which Trim39, Trim17, and SUMO regulate the stability of NFATc3.During my PhD, I have characterized Trim39 as an E3 ubiquitin-ligase of NFATc3. Indeed, my results indicate that overexpression of Trim39, but not its inactive mutant, induces the ubiquitination of NFATc3 in cells. In contrast, silencing of endogenous Trim39 decreases the ubiquitination level of NFATc3. Recombinant Trim39 directly induces the ubiquitination of NFATc3 in vitro. Moreover, overexpression of Trim39 decreases the protein levels of NFATc3 whereas the silencing of Trim39 increases it. I have also shown that Trim17, which can bind Trim39, inhibits Trim39-mediated ubiquitination of NFATc3, both in cells and in vitro. Trim17 acts by both reducing the intrinsic E3 ubiquitin-ligase activity of Trim39 and by preventing the interaction between NFATc3 and Trim39. Furthermore, I found that a SUMOylation-deficient mutant of NFATc3 is less ubiquitinated and more stable than the wild type NFATc3, suggesting that SUMOylation of NFATc3 is important for its ubiquitination and degradation. Importantly, I identified one SUMO interacting motif (SIM) in the sequence of Trim39 through which Trim39 binds SUMO2 polymers via one of these SIMs. Mutation of this SIM in Trim39 or SUMOylation consensus sites in NFATc3 decreased the interaction between Trim39 and NFATc3, and the ubiquitination of NFATc3 mediated by Trim39. These results strongly suggest that Trim39 binds and ubiquitinates preferentially the SUMOylated forms of NFATc3 and therefore acts as a SUMO-targeted E3 ubiquitin-ligase (STUbL) for NFATc3. Finally, we have measured the impact of these mechanisms on the physiological function of NFATc3. I first found that Trim39 decreases the transcriptional activity of NFATc3. Furthermore, using primary cultures of cerebellar granule neurons as a model, we have shown that the mutation of the SUMOylation sites of NFATc3 and silencing of endogenous Trim39 enhances neuronal apoptosis, probably by stabilizing the NFATc3 protein. Taken together, these data indicate that Trim39 modulates neuronal apoptosis by acting as a STUbL for NFATc3 and by controlling its stability.; Les facteurs de transcription NFAT (facteur nucléaire des cellules T activées) jouent un rôle physiologique important dans le développement et le fonctionnement de nombreux organes, notamment dans le système immunitaire et le système nerveux. Par conséquent, leur dérégulation a été impliquée dans diverses maladies humaines telles que le cancer, les maladies neurodégénératives et les maladies auto-immunes. La régulation de l'activité de NFAT par translocation nucléo-cytoplasmique a été largement étudiée. En revanche, la régulation du niveau protéique de NFAT par le système ubiquitine-protéasome est encore mal comprise. Pourtant, les protéines NFAT ont une durée de vie courte et la régulation de leur stabilité est donc essentielle pour le contrôle de leur activité.Dans une étude précédente, mon groupe a montré que l'E3 ubiquitine-ligase Trim17 se lie à NFATc3 mais ne favorise pas son ubiquitination et tend plutôt à stabiliser la protéine. Les résultats préliminaires obtenus suggéraient que Trim39, un partenaire de Trim17, pourrait être une E3 ubiquitine-ligase pour NFATc3 et que la SUMOylation de NFATc3 modulait sa stabilité. L'objectif de ma thèse était donc de comprendre les mécanismes par lesquels Trim39, Trim17 et SUMO régulent la stabilité de NFATc3.Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé Trim39 comme une E3 ubiquitine-ligase de NFATc3. En effet, mes résultats indiquent que la surexpression de Trim39, mais pas de son mutant inactif, induit l'ubiquitination de NFATc3 dans les cellules. En revanche, la déplétion de Trim39 endogène diminue le niveau d'ubiquitination de NFATc3. La protéine Trim39 recombinante induit directement l'ubiquitination de NFATc3 in vitro. De plus, la surexpression de Trim39 diminue les niveaux protéiques de NFATc3 alors que la déplétion de Trim39 les augmente. J'ai également montré que Trim17 inhibe l'ubiquitination de NFATc3 induite par Trim39, à la fois dans les cellules et in vitro. Trim17 agit à la fois en réduisant l'activité E3 ubiquitine-ligase intrinsèque de Trim39 et en empêchant l'interaction entre NFATc3 et Trim39. En outre, j'ai montré qu'un mutant de NFATc3 ne pouvant être SUMOylé est moins ubiquitiné et plus stable que la forme sauvage de NFATc3, ce qui suggère que la SUMOylation de NFATc3 est importante pour son ubiquitination et sa dégradation. En outre, j'ai identifié un motif d'interaction à SUMO (SIM) dans la séquence de Trim39, par lequel Trim39 lie les polymères de SUMO2. La mutation de ce SIM dans Trim39 ou des sites consensus de SUMOylation dans NFATc3 diminue l'interaction entre Trim39 et NFATc3, et l'ubiquitination de NFATc3 induite par Trim39. Ces résultats suggèrent fortement que Trim39 reconnaît et ubiquitine préférentiellement les formes SUMOylées de NFATc3 et agit donc comme une « E3 ubiquitine-ligase guidée par SUMO » (STUbL) pour NFATc3. Enfin, nous avons mesuré l'impact de ces mécanismes sur la fonction physiologique de NFATc3. J'ai tout d'abord montré que Trim39 diminue l'activité transcriptionnelle de NFATc3. En outre, à l'aide de cultures primaires de neurones granulaires du cervelet, nous avons montré que la mutation des sites de SUMOylation de NFATc3 et la déplétion de Trim39 endogène aggravent l'apoptose neuronale, probablement en stabilisant la protéine NFATc3. En conclusion, l’ensemble de mes données indiquent que Trim39 module l'apoptose neuronale en agissant comme une STUbL pour NFATc3 et en contrôlant sa stabilité. |
