Identification, quantification et caractérisation de l'ADN mitochondrial au cours de la polyarthrite rhumatoïde

Autor: Mitrovic, Stéphane
Přispěvatelé: UB -, BU Carreire
Jazyk: francouzština
Rok vydání: 2015
Předmět:
Popis: Introduction: Mitochondrial DNA (mtDNA) is very similar to bacterial DNA. Recent works suggest that this mtDNA could act like an alarmine, especially in inflammatory situations. Objectives: To identify and quantify this mtDNA in synovial fluids (SF) and plasma of patients suffering from rheumatoid arthritis (RA), and to search proinflammatory characteristics. To study the putative role of mtDNA on the RANK/RANK-L system. Material and Methods: The plasma and SF of patients suffering from osteoarthritis (OA) were collected from the Rheumatology department of the Teaching Hospital of Bordeaux, during current medical acts. The samples were first purified on special kits, before searching and quantifying extracellular mtDNA through quantitative PCR (qPCR). The polymorphonuclears (PMNs) were also isolated from the same samples and purified. We searched through Western-Blotting of the SF the mitochondrial transcription factor A (TFAM), well known for its association to mtDNA and its proinflammatory role. We searched an excessive oxidation of mtDNA in RA DNA samples compared to controls through ELISA quantification of proinflammatory 8-oxo-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) motives. PMNs were incubated with mtDNA extracted from JRT3 cells, and were then analysed through flow-cytometry to check whether PMNs stimulation by mtDNA could up-regulate RANK-L expression on their membranes. Results: 1) RA SF (n=27) contain statistically more mtDNA copies than OA SF (n=12): mean 749147 copies/mL +/- SD 310776 versus 5460 copies/mL +/- 4507, p=0,0007, Kruskal-Wallis test. The higher the disease activity was, the higher this mean extracellular mtDNA level was. 2) The levels were statistically higher in RA plasma (n=40) when compared to healthy donors plasma (n=15): respectively mean of 124989 copies/mL +/- 25952 versus 24210 copies/mL +/- 11067, p=0,0237, Kruskal-Wallis test. 3) In patients with RA, the intracellular mt DNA content, evaluated through mt DNA/ nuclear mean ration, was 4,59 times higher inside the blood PMN than inside the articular PMNs. 4) TFAM was inconstantly found in RA SF (6 out of 14), but never in OA SF. 5) There was no increased level of 8-oxo-dG in RA DNA when compared to healthy subjects. 6) The incubation of PMNs with mtDNA up-regulates RANK-L expression on the cellular membrane of these cells. Conclusion: RA SF have higher levels of extracellular mt DNA compared to OA SF. On the contrary, SF PMNs have a decreased intracellular level of mtDNA, suggesting that those cells could be a source of mt DNA liberation in the joint. Mitochondrial DNA stimulates RANK-L expression on the cellular membrane of PMNs. Thus, mtDNA could directly contribute to RA physiopathology.
Introduction : L'ADN mitochondrial (ADN mt) présente de fortes homologies avec l'ADN bactérien. Plusieurs travaux récents suggèrent que cet ADN mt peut se comporter comme une alarmine, notamment en contexte inflammatoire. Objectifs : Identifier et quantifier cet ADN mt dans le liquide synovial (LS) et le plasma de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR), et rechercher la présence de caractéristiques pro-inflammatoires. Etudier le rôle de l’ADN mt sur le système RANK/RANK-L. Matériels et méthodes : Les plasmas et LS de patients atteints de PR et d’arthrose (OA) ont été obtenus auprès du service de Rhumatologie du CHU de Bordeaux dans le cadre de soins courants. Ils ont d’abord été purifiés sur colonnes, avant de rechercher et quantifier leur contenu en ADN mt extracellulaire par PCR quantitative (qPCR). Les polynucléaires neutrophiles (PNN) ont également été isolés à partir des mêmes échantillons et purifiés. Leur contenu en ADN mt intracellulaire a été évalué par qPCR. Nous avons recherché dans les LS par Western-Blot la protéine TFAM (mitochondrial transcription factor A), connue pour son association à l’ADN mt et son rôle pro-inflammatoire. La recherche d’oxydation excessive de l’ADN mt de PR par rapport aux témoins a été réalisée par la recherche de séquences pro-inflammatoires 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-oxodG) en ELISA. Les PNN ont été incubés avec de l’ADN mt extrait de cellules JRT3, ava! nt d’être passés en cytométrie de flux pour rechercher si la stimulation par l’ADN mt pouvait entraîner une augmentation de l’expression membranaire de RANK-L. Résultats : 1) Les LS de PR (n=27) contiennent statistiquement plus de copies d’ADNmt que les LS d'arthroses (n=12) : moyenne +/- SD de 749147 copies/mL +/- 310 776 versus 5460 copies/mL +/- 4507, p=0,0007, test de Kruskal-Wallis. Ce taux moyen d'ADN mt extracellulaire était d'autant plus important que l'activité de la maladie était importante. 2) Les taux étaient statistiquement plus élevés dans les plasmas de PR (n=40) comparativement aux plasmas de témoins sains (n=15) : respectivement moyenne +/- SD de 124989 copies/mL +/- 25952 versus 24210 copies/mL +/- 11067, p=0,0237, test de Kruskal-Wallis. 3) Chez les sujets avec PR, le contenu intracellulaire en ADNmt, évalué par le ratio ADN mt/ADN nucléaire moyen, est 4,59 fois plus élevé à l’intérieur des PNN sanguins qu’à l’intérieur des PNN articulaires. 4) La protéine TFAM n’est retrouvée que de façon inconstante dans les LS de PR (6 sur 14), mais jamais dans les LS d’OA. 5) Nous n’avons pas mis en évidence d’augmentation du taux de 8-oxodG dans l’ADN de nos patients PR comparativement aux contrôles. 6) L’incubation de PNN sanguins avec de l’ADN mt induit l’expression de RANK-L à leur surface cellulaire. Conclusion : Le LS de PR se caractérise par des taux augmentés d’ADN mt extracellulaire comparativement aux sujets arthrosiques. En revanche, les PNN du LS ont un taux d’ADN mt intracellulaire abaissé, suggérant que ces cellules pourraient être la source de l’ADN mt libéré dans l’articulation. L’ADN mt stimule l’expression membranaire de RANK-L à la surface des PNN, et pourrait ainsi contribuer directement à la physiopathologie de la PR.
Databáze: OpenAIRE
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