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Doutoramento em Biologia The overarching objective of this thesis was to explore ecologically relevant scenarios of contamination by agrochemical fungicides, in particular their interaction with disease (a ubiquitous and relevant natural stressor), using a host (Daphnia spp.) × parasite (Metschnikowia bicuspidata) system as an experimental model. Because parasites act as modulators of population dynamics and genetic diversity, interaction scenarios between disease and anthropogenic factors (namely pollution) are important to clarify. For this work, copper sulphate and tebuconazole were selected as chemical stressors, given their widespread use as fungicides and frequent detection in aquatic systems. This thesis presents a sequential series of research steps that were undertaken to assess the hazards posed by these chemicals under multi-stressor (i.e., realistic) scenarios. First, we assessed the toxicity of copper sulphate and tebuconazole in two host (Daphnia) clones, considering their joint effects with increasing temperatures. This allowed simulating two important agents of environmental change. Temperature was the most influencing factor on Daphnia fitness, although both copper and tebuconazole reduced the fecundity and survival of Daphnia. A temperature-dependent pattern was found for both fungicides, although this was highly context-dependent. Second, we investigated the reciprocal effects of these pollutants and parasite challenge, using the Daphnia-M. bicuspidata experimental system. The toxicants decreased Daphnia fitness, whilst the parasite strongly reduced host survival. Whilst copper sulphate and parasite effects were mostly independent, tebuconazole suppressed the M. bicuspidata infection at an environmentally relevant range of concentrations (> 6.25 μg l-1). Third, these contrasting outcomes were assessed at two distinct temperatures, because temperature is an important modulator of both toxicity and hostparasite relationships. Indeed, we observed that temperature increased parasite virulence and acted as a modulator of existent interactions between pollution and disease (in the case of tebuconazole). Based on these evidences, we directed our focus to the observed anti-parasitic effect of tebuconazole, which we hypothesize that is more widespread than reported. In a fourth step, we evaluated the influence of different exposure scenarios to tebuconazole (timing × concentration) on the Daphnia-M. bicuspidata experimental system. Infection data revealed an “all-or-nothing” effect, with tebuconazole suppressing infection within a narrow range of tebuconazole concentrations (3.65–13.5 μg l-1). We were able to confirm that tebuconazole inhibited sporulation of M. bicuspidata, and possibly also the vegetative growth of the yeast cells. Finally, we determined if M. bicuspidata could adapt to this anthropogenic selective pressure, by experimentally promoting the rapid evolution of M. bicuspidata lineages to tebuconazole. Infectivity, spore load and survival time of the infected hosts revealed that evolved parasite lineages performed worse than naive lineages, although this could be easily reversed after removal of the stressor. This demonstrates that there were transient costs of prolonged exposure to tebuconazole and that the microparasitic yeast M. bicuspidata did not reveal potential for rapid evolution to the fungicide. Altogether, our findings support the idea that long term exposure to tebuconazole is hazardous to non-target fungi at environmentally realistic concentrations, putatively affecting numerous microparasites and decomposers, as well as the processes were they intervene (disease and decomposition). Copper sulphate, on the other hand, revealed a less contextdependent toxicity pattern, without interacting with parasitism in this case. Our findings with tebuconazole demonstrate negative ecological effects of antifungal agents (which include agrochemicals and pharmaceuticals, many sharing mode of action), which may have so far been overlooked. O objetivo fundamental desta tese centrou-se na exploração de cenários ecologicamente relevantes de contaminação por fungicidas, e em particular a sua interação com a doença (um factor de stress natural e omnipresente), usando para isso um modelo experimental composto por um hospedeiro (Daphnia spp.) e um parasita (Metschnikowia bicuspidata). Tendo em conta o papel importante dos parasitas como moduladores da diversidade genética e dinâmica das populações, torna-se importante clarificar cenários de interação entre doença e factores antropogénicos (nomeadamente a poluição). Neste trabalho, selecionou-se o sulfato de cobre e o tebuconazole como fatores de stress químico, devido ao seu amplo uso como fungicidas e frequente deteção em sistemas aquáticos. Esta tese apresenta-se como uma sequência de etapas de investigação, realizadas com o intuito de avaliar os perigos apresentados por estes agentes químicos em cenários de stress múltiplo (i.e. mais próximos da realidade). Primeiro, a toxicidade de sulfato de cobre e tebuconazole foi determinada em dois hospedeiros (dois genótipos de Daphnia), considerando os seus efeitos interativos com o aumento de temperatura. Estes cenários permitiram-nos simular dois agentes importantes de mudanças ambientais. Apesar de ambos os fungicidas (cobre e tebuconazole) reduzirem a fecundidade e sobrevivência de Daphnia, a temperatura foi o factor mais preponderante no desempenho de Daphnia. Neste sentido, observou-se um padrão de toxicidade dependente da temperatura para ambos os fungicidas, apesar de altamente dependente do contexto. Em segundo lugar, os efeitos recíprocos destes poluentes e do parasitismo foram avaliados, usando o modelo experimental Daphnia- Metschnikowia. Enquanto os poluentes diminuiram o desempenho reprodutivo de Daphnia, o parasita afetou principalmente a sobrevivência do hospedeiro. Além disso, enquanto os efeitos do sulfato de cobre e do parasita foram maioritariamente independentes, o tebuconazole suprimiu a infeção de M. bicuspidata a concentrações ambientalmente relevantes (> 6,25 μg l-1). Em terceiro lugar, e tendo em conta o potencial da temperatura como moduladora de toxicidade dos contaminantes e das relações hospedeiro-parasita, avaliámos o desfecho da interação parasita × contaminante quando o modelo experimental foi exposto a duas temperaturas distintas. De facto, a temperatura revelou ser capaz de aumentar a virulência do parasita e de modular interações existentes entre a poluição e a doença (no caso do tebuconazole). Tendo em conta as evidências recolhidas até este ponto, o foco do nosso trabalho foi dirigido para o efeito anti-parasitário do tebuconazole, que hipotetizamos ser mais disseminado do que o reportado até agora. Assim, numa quarta etapa investigativa, a influência de diferentes cenários de exposição ao tebuconazole (tempo de exposição × concentração) foi determinada, usando o modelo experimental Daphnia-Metschnikowia. Os dados de infetividade revelaram um efeito “tudo-ou-nada” causado pelo tebuconazole, confirmado pela supressão da infeção dentro de uma gama estreita de concentrações (3,65–13,5 μg l-1). Com estes resultados, foi possível confirmar que o tebuconazole inibiu a esporulação de Metschnikowia, e possivelmente o crescimento vegetativo das células desta levedura. Finalmente, com o intuito de determinar se M. bicuspidata conseguiria adaptarse a esta pressão seletiva, promovemos experimentalmente a rápida evolução de linhagens de Metschnikowia ao tebuconazole. A infectividade, o número (carga) de esporos e o tempo de sobrevivência dos hospedeiros infetados revelaram que as linhagens expostas ao tebuconazole tiveram um pior desempenho quando comparados com as linhagens não expostas ao tebuconazole. Ainda assim, este efeito negativo foi facilmente revertido após a remoção desta pressão selectiva. Estas evidências demonstram custos transientes associados a uma exposição prolongada ao tebuconazole, sendo que o microparasita M. bicuspidata não revelou potencial para uma evolução rápida ao tebuconazole. Em conjunto, os nossos resultados confirmam que a exposição prolongada a concentrações ambientalmente relevantes de tebuconazole é nociva para comunidades de fungos não-alvo, podendo assim afetar numerosos microparasitas e decompositores, assim como os processos onde eles intervêm (doença e decomposição). O sulfato de cobre, por outro lado, revelou um padrão de toxicidade menos dependente do contexto, e sem qualquer interação com o parasitismo. As nossas descobertas demonstraram potenciais efeitos ecológicos negativos de agentes anti-fúngicos (que incluem agroquímicos e fármacos, muitos dos quais partilham o mesmo modo de ação), que poderão ter sido negligenciados até agora. |
