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Male fertility relies on the ability of spermatozoa to fertilize the egg in the female reproductive tract. It is known that three protein phosphatases (PPs) are crucial in sperm motility acquisition and regulation, the sperm-specific PP type 1 isoform gamma 2 (PP1γ2), protein phosphatase type 2A (PP2A) and protein phosphatase type 2B (PP2B). An interplay between these PPs has been extensively investigated, with the contribution of some PP inhibitors, however, several were never reported to be tested in spermatozoa. This study aimed to assess the motility pattern alterations following incubation with cantharidin (CAN) and tautomycin (TAU), which inhibit PP1 and PP2A, as well as cypermethrin (CYP), a PP2B inhibitor. Besides, a machine learning-based method of analysis (alternative analysis) was used along with the Computer-Aided Sperm Analysis (CASA) system. CASA results showed that PP inhibitors caused an increase in immotility paired with decreased rapidly-progressive (RP) motility and velocity of the kinematic parameters. The alternative analysis also revealed an increase in hyperactivated spermatozoa and circular trajectories and, contrarily, an increase in RP spermatozoa. CAN affected more significantly RP spermatozoa, whereas TAU most impacted slowly-progressive (SP). CYP caused a significant impact in both RP and SP, being the inhibitor that caused more significant decreases in sperm motility and kinematic parameters. Results from both analyses, CASA and alternative analysis, were often divergent, which could be explained by the differences between the methods, such as video frame rate and height of the analysis chambers. In conclusion, contrarily to the literature, CAN, TAU and CYP consistently decreased spermatozoa motility and kinematic parameters, without affecting cell viability. Hence, additional studies are required to further understand PPs role in activated and hyperactivated motility regulation. A fertilidade masculina depende da capacidade dos espermatozóides de fertilizar o ovócito no sistema reprodutivo feminino. Atualmente, sabe-se que três proteínas fosfatases (PFs) têm um papel crucial na aquisição e regulação da motilidade do espermatozoide, a isoforma espermática tipo 1 gama 2 (PF1γ2), proteína fosfatase tipo 2A (PF2A) e proteína fosfatase tipo 2B (PF2B). A interação entre estas PFs tem sido extensivamente investigada, graças à contribuição dos inibidores de PF, contudo, uma grande parte deles nunca foi testado em espermatozóides. Este estudo teve como objetivo avaliar as alterações do padrão de motilidade dos espermatozóides, após a incubação com cantaridina (CAN) e tautomicina (TAU), que inibem PF1 e PF2A, assim como a cipermetrina (CYP), um inibidor de PF2B. Além disso, foi utilizado um método de análise baseado em machine-learning (análise alternativa), além da análise do sistema Computer-Aided Sperm Analysis (CASA). Os resultados da análise CASA mostraram que os inibidores de PF causaram um aumento na imotilidade, aliado a uma diminuição da motilidade progressiva rápida (PR) e da velocidade dos parâmetros cinemáticos. A análise alternativa também revelou um aumento dos espermatozóides hiperativados e com trajetórias circulares, assim como, contrariamente, um aumento dos espermatozóides PR. CAN afetou mais significativamente os espermatozoides PR, enquanto que TAU afetou mais os espermatozoides progressivos lentos (PL). CYP causou um impacto significativo tanto nos PR, como nos PL, sendo este o inibidor que causou decréscimos mais significativos tanto na motilidade, como nos parâmetros cinemáticos. Os resultados das duas análises foram por vezes divergentes, o que pode ser explicado por diferenças entre os métodos, como por exemplo o frame rate dos vídeos e a altura das câmaras de análise. Concluindo, contrariamente ao descrito na literatura, os nossos resultados mostram que CAN, TAU e CYP diminuíram consistentemente a motilidade e os parâmetros cinemáticos dos espermatozoides, sem afetar a viabilidade celular. Assim, estudos adicionais são necessários de modo a entender melhor o papel dos PFs na regulação da motilidade ativada e hiperativada. Mestrado em Bioquímica |
