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AmtR spielt eine zentrale Rolle im Stickstoffmetabolismus von Corynebacterium glutamicum, einem Actinomyceten von herausragender industrieller Bedeutung. Im Zusammenspiel mit den Signaltransduktionsproteinen GlnD und GlnK stellt AmtR als Masterregulator der Aufnahme und Assimilation von Stickstoff eine wesentliche Funktion in der Herstellung biotechnologisch relevanter Aminosäuren dar. Das AmtR-Regulon und der Regulations-mechanismus wurden bisher eingehend untersucht. In dieser Arbeit wurde der Regulator AmtR, ein Mitglied der TetR-Familie, bezüglich seiner Interaktion mit der DNA und dem PII-Typ Protein GlnK detaillierter analysiert. Um für Interaktionen relevante Aminosäuren in AmtR zu identifizieren, wurden Aminosäurereste im putativen DNA- und GlnK-Interaktionsbereich modifiziert. Die so variierten AmtR-Proteine wurden gereinigt und in Bindestudien auf ihre Interaktionsfähigkeit mit der DNA bzw. dem GlnK-Protein untersucht. Auf diese Weise konnten, in Kombination mit bioinformatischen Analysen, Aminosäuren von entscheidender Stellung innerhalb der AmtR-DNA-Interaktionsfläche determiniert werden. Hinsichtlich der Interaktion von AmtR und GlnK ergab sich die Problematik, dass die Expression von GlnK im Ursprungsstamm C. glutamicum stattfinden musste, da GlnK lediglich in adenylylierter Form mit AmtR interagiert. Trotzdem wurden in Gelretardationsexperimenten wichtige Aminosäurereste der AmtR-GlnK-Interaktion identifiziert. Ein Protokoll zur Reinigung von GlnK-AMP in großem Maßstab konnte in dieser Arbeit nicht etabliert werden. Auf Ebene der DNA-Bindestelle innerhalb der AmtR-DNA-Interaktion wurde aufgezeigt, dass weniger die Sequenz als viel mehr die Länge des Zwischenstücks der Palindrome entscheidend für die Bindung von AmtR ist. Die Sequenz der DNA-Bindestelle ist für die Stärke der AmtR-Bindung und damit für die Stringenz der Repression des Gens durch AmtR ausschlaggebend. Im Verlauf dieser Untersuchungen wurde die AmtR-Autoregulation wiederhergestellt mit dem Ergebnis, dass eine AmtR-Autoregulation die Stickstoffmangelantwort verlangsamt. Zusätzlich zur biochemischen Betrachtung des AmtR-Proteins fanden in dieser Arbeit verschiedene Ansätze zur Lösung der dreidimensionalen Struktur über Kristallisation statt. In Kooperation mit der AG Muller gelang es, die Struktur des ungebunden AmtR-Proteins und eines AmtR-DNA-Komplexes zu lösen. AmtR plays a major role in nitrogen metabolism of Corynebacterium glutamicum, an actinomycete of outstanding industrial importance. As the master regulator of uptake and assimilation of nitrogen, AmtR represents a crucial function in production of relevant amino acids, in interaction with the signal transduction proteins GlnD and GlnK. The AmtR regulon and the mechanism of regulation have been described extensively. In this study the regulator AmtR, which is a member of the TetR family, has been studied in detail concerning its interactions with DNA and with the PII type protein GlnK. In order to identify relevant amino acids of interaction in AmtR, residues inside of the putative DNA and GlnK interaction domain were modified. The AmtR variants were purified and analyzed in binding studies, regarding their ability to interact with DNA or GlnK. Thus, combined with bioinformatical modeling, amino acids of importance within the AmtR-DNA interface could be determined. In respect of the interaction of AmtR and GlnK the major obstacle was the fact that GlnK only binds to AmtR in its adenylylated state, so expression of GlnK had to take place in the origin strain C. glutamicum. Nevertheless important residues in the AmtR-GlnK interaction could be determined via gel retardation assays. A protocol for large scale purification of GlnK-AMP could not be established in this study. The AmtR-DNA interaction was also investigated on the level of DNA. It could be shown that rather spacing of nucleotides than the sequence of the AmtR binding site is important for AmtR binding. The sequence of the AmtR binding site plays a role in binding strength, hence in stringency of AmtR repression. In the context of this investigation the auto-regulation of AmtR could be restored with the result that AmtR auto-regulation slows down the response to nitrogen starvation. In addition to the biochemical analysis of AmtR several crystallization trials were performed to obtain the 3-dimensional structure of AmtR. The structure of the unbound AmtR protein and of an AmtR-DNA complex could be solved in cooperation with the group of Y. Muller. |
