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Ionisierende Strahlung wird in der Medizin in den Bereichen der Diagnostik, der Forschung und der Strahlentherapie genutzt. Um nach Bestrahlung und potentiellem DNA-Schaden das Überleben einer Zelle zu sichern oder bei Bedarf in den gezielten Zelltod (Apoptose) zu gehen, ist die posttranslationale Modifikation eine wichtige Option für die Zelle. Posttranslationale Modifikation bedeutet, dass Proteine nach ihrer Entstehung, zum Beispiel durch Kinasen verändert werden können. So stellen Phosphorylierungen und Acetylierungen einen Teil dieser posttranslationalen Modifikation dar. Ziel dieser Arbeit war es Phosphorylierungen in Abhängigkeit der Bestrahlungsdosis und der Reparaturzeit zu betrachten.Es wurde die normale menschliche Zelllinie Sbl1 und eine NBS-/-- Zelllinie (P122) untersucht. Die lymphoblastoiden Zellen wurden sowohl unbestrahlt als auch mit 5Gy bestrahlt und nach einer Reparaturzeit von 1h, 3h, 8h, 24h, 48h betrachtet. Anfangs wurden die gesuchten Proteine Pml und Nbs1 mittels eindimensionaler Gelektrophorese und anschließender Silberfärbung, bzw. Western Blot detektiert. Danach wurde das Kernprotein mit der zweidimensionalen Gelelektrophorese aufgetrennt und im Western Blot Pml und Nbs dargestellt. Anschließend wurden die Ergebnisse mit einem Bildanalyseprogramm ausgewertet.Bei der normalen Zelllinie konnte bei unbestrahltem Pml im Durchschnitt neun negative Ladungen gefunden werden. Die durchschnittlichen Ladungsmaxima mit 14 Ladungen besitzt Pml drei und acht Stunden nach Bestrahlung mit 5Gy. Die durchschnittliche Anzahl der Ladungen beginnt nach 24 Stunden zu sinken. Nach 48 Stunden ist ein weiteres Absinken zu beobachten. Bei der NBS-/-- Zelllinie konnte ebenfalls eine Steigerung von zehn Ladungen unbestrahlt auf 16 Ladungen nach Bestrahlung beobachtet werden. Jedoch ist dieses Ladungsmaximum erst nach 24 Stunden Reparaturzeit zu verzeichnen. Nach 48 Stunden kommt es zu einem Absinken der durchschnittlichen Ladungsanzahl. Das Nbs1-Protein der gesunden Zelllinie besitzt unbestrahlt im Durchschnitt zwei Ladungen. Nach Bestrahlung mit 5Gy kommt es zu einem Anstieg auf bis zu sechs Ladungen.In der Arbeit konnten Aussagen über die Veränderung der posttranslationalen Modifikationen im Sinne von Phosphorylierungen getroffen werden, welche die Zahl und die Steigerung der Veränderungen beschreiben. Es konnte festgestellt werden, dass durch eine Bestrahlung mit 5Gy eine Hochregulation der Vorgänge in der Zelle erfolgt, diese ist von der Reparaturzeit abhängig. In den NBS-/-- Zellen findet diese Hochregulation jedoch später statt, als in gesunden Zelllinien. In medicine ionizing irradiation is used in the areas diagnostic, research and radiotherapy. Posttranslational modification is an important option for the cell to protect its survival after ionizing irradiation and potential DNA damage or, if necessary, to choose the apoptosis. Posttranslational modification means that after their syntethis, proteins are changed for example by kinases. Phosphorylation and acetylation are part of this posttranslational modification. An aim of this work was to analyse phosphorylation against radiation dose and repair time. A normal human cell line Sbl2 and a NBS-/--cell line were examined. Non-irradiated lymphoblastoide cells were observed, as well as treated lymphoblastoide cells, whereas the latter were irradiated with 5Gy and left to repair for 1h, 3h, 8h, 24h and 48h. In the beginning Pml and Nbs were detected by one-dimensional gel electrophoresis and following silver stain or Western Blot respectively. Then the proteins of the nuclei were analyzed with two-dimensional gel electrophoresis and afterwards Pml and Nbs1 were shown in Western Blots. The results were evaluated with an image analysis program. In normal cell line an average of nine negative charges could be found for unirradiated Pml. Pml has its maximal number of negative charges three and eight hours after irradiation with 5Gy. This maximum is 14 negative charges. The average number of negative charges begins to fall after 24 hours. After 48 hours a further descent could be registered. In the NBS-/--cell line an increase of ten negative charges unirradiated to 16negative charges after treatment could be observed. But this maximum of charges can be registered not until 24 hours reparation time. After 48 hours there is a descent of the average number of charges. The unirradiated Nbs1-protein of the healthy cell line has got two negative charges. After treatment with 5Gy there is an increase up to six negative charges. In this work changes in posttranslational modifications through phosphorylation could be shown. Moreover the strength of increase of charges could be described. It could be detected that an irradiation with 5Gy triggers an increase of procedures in a cell, depending on reparation time. In the NBS-/--cell line this increase occurs later than in normal cell lines. |
