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Tribolium castaneum eignet sich aufgrund der in dieser Spezies sehr effizienten RNA Interferenz gut für vergleichende, funktionelle Untersuchungen. In der vorliegenden Arbeit wurde auf diese Weise eine erste genetische Analyse der Oogenese dieses Käfers durchgeführt (Projekt 1). Da sich solche Ansätze über Kandidatengene weitgehend auf konservierte Gene beschränken, gibt es auch in Tribolium das Bedürfnis, unvoreingenommen neue Genfunktionen zu identifizieren, deren Auswahl also möglichst keinem systematischen Fehler unterliegt. Dazu wurde in Kollaboration mit drei weiteren Laboren eine Insertionsmutagenese durchgeführt (Projekt 2). Von diesem Screen versprachen wir uns auch eine wesentliche Unterstützung des Oogenese-Projektes in Form von Mutanten und von enhancer trap-basierten Markerstämmen. Projekt 1: Tribolium besitzt telotroph meroistische Ovariolen des Polyphaga Typus. Während larvaler Stadien bilden die Keimbahnzellen in einer ersten mitotischen Phase kleine, irregulär verzweigte Cluster, die die gesamte Gonadenanlage besiedeln. Nur diejenigen Cluster, die Kontakt zum posterioren somatischen Gewebe haben, überleben und initiieren während des Puppenstadiums eine zweite mitotische Phase der Keimbahnzellen. Dabei entstehen zumeist lineare Subcluster, deren Zellen sich später überwiegend in Nährzellen entwickeln. Die Keimbahnzellen im posterioren Bereich des Trophariums differenzieren sich zu Oocyten und treten mit Beginn der Adultphase einzeln in das sich bildende Vitellarium ein, wo sie von somatischen Follikelzellen umhüllt werden. Im Gegensatz zum Modellorganismus Drosophila melanogaster ist über die genetische Regulation der Oogenese von Tribolium casta- neum nur wenig bekannt. Erste hier durchgeführte RNAi Analysen zeigen, dass das Überleben der Keimzellcluster während früher larvaler Stadien vom piwi Signalweg abhängig ist. Des Weiteren führt RNAi gegen Komponenten des JAK/STAT Signalweges zu einer fehlerhaften Anordnung der Follikel im Vitellarium und es differenzie- ren sich keine weiteren Stielzellen. Damit üben diese beiden Gene in Tribolium - trotz des sehr unterschiedlichen Oogenese-Typus - durchaus ähnliche Funktionen aus wie in Drosophila. Projekt 2: Im Rahmen des GEKU Insertionsmutagenesescreens mit dem Transposon piggyBac konnten nahezu 100 homozygot letale sowie mehr als 40 enhancer trap Insertionslinien generiert werden. Die Bestimmung der Integrationspunkte der neuen Insertionen im Tribolium Genom zeigt, dass sie nahezu gleichmäßig über das gesamte Genom verteilt sind. Mehr als zwei Drittel aller letalen Insertionen liegen innerhalb eines annotierten Gens. Da alle verwendeten genetischen Elemente speziesunabhängig sind und zudem ohne den Einsatz von Balancerchromosomen auskommen, sollten die bei der Insertionsmutagenese angewandten Methoden weitestgehend auch auf andere Insektenspezies übertragbar sein. Allerdings muss dieses Mutagenesesystem noch weiter verbessert werden - so scheint das verwendete Reportergensystem gegenüber ovarspezifischen Enhancern insensitiv zu sein, ein Problem, das vermutlich durch Verwendung anderer basaler Promotoren gelöst werden kann. Given its sequenced genome and efficient systemic RNA interference response, Tribolium castaneum is well suited for functional approaches via candidate genes. Using this strategy, the first functional analysis of oogenesis in this beetle was performed (project 1). To escape the bias inherent in candidate gene approaches there is a pressing need for forward genetic analysis. Therefore, we undertook in collaboration with three more groups a largescale transposon mutagenesis screen. Project 1: Tribolium has telotrophic meroistic ovarioles of the Polyphaga type. During larval stages, germ cells multiply in a first mitotic cycle forming many small, irregularly branched germ-cell clusters, which colonize the ovariole anlage. Only those clusters survive that adjoin posterior somatic tissue survive; those clusters initiate a second wave of metasynchronous mitoses during pupal stages. This results in linear subclusters with few bifurcations. All anteriorly located cells of these clusters will develop into nurse cells while germline cells in posterior regions of the tropharium differentiate into oocytes. During adult stages, these cells and enter the vitellarium one by one where they are enveloped by somatic follicle cells. In contrast to Drosophila, only little is known about regulatory functions in the Tribolium ovary. Through RNAi analysis I could show that the survival of germ cell clusters during early larval stages depends on piwi. Furthermore, RNAi against components of the JAK/STAT pathway resulted in misarranged follicles in the vitellarium, and stalk cells failed to differentiate. This work showed that RNAi is effective during Tribolium oogenesis, and it hints at conserved molecular functions of these two factors in this ovary type. Project 2: In a large-scale insertional mutagenesis screen, almost 100 homozygous lethal piggyBac insertions and more than 40 insertions displaying an enhancer trap activity could be generated. These new insertions are randomly distributed throughout the genome and more than two thirds of the lethal insertions are located within transcription units. Because the genetic elements used in this screen are not species-specific, and because the crossing scheme does not depend on balancer chromosomes, the methods presented herein should be broadly applicable for many insect species. However, this system has to be improved further as the reportergene system seems to be insensitive for ovary specific enhancers. This problem might be solved in the future by the use of other basal promoters. |
