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Störungen der psychomotorischen Entwicklung sind klinisch und genetisch sehr heterogen. Häufig liegen Veränderungen in verschiedenen Genen zugrunde, deren Genprodukte jedoch in einem gemeinsamen molekularen Netzwerk oder Signalweg verbunden sind. Eine dieser molekularen/funktionellen Einheiten, die in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen hat, ist die Chromatin- und Transkriptions-Regulation. Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei Gene untersucht, die mit Entwicklungsstörungen assoziiert und in diese Prozesse involviert sind: a) PHF6, ein potenzieller Chromatin-Regulator, in dem pathogene Varianten mit dem X-chromosomalen Börjeson-Forssman-Lehmann Syndrom (BFLS) assoziiert sind, und b) SCAF4, ein transkriptioneller Terminator, welcher bisher noch nicht mit Störungen der neuralen und mentalen Entwicklung assoziiert war. Im ersten Teil meiner Dissertation habe ich mich mit den molekularen Pathomechanismen des BFLS befasst. Da es phänotypische Unterschiede zwischen betroffenen Männern mit X-chromosomal rezessiv vererbten und betroffenen Frauen mit de novo Varianten in PHF6 gibt, habe ich PHF6-Varianten hinsichtlich ihrer funktionellen Konsequenzen untersucht. In silico Modellierung von Missense-Varianten in den ePHD (extended plant homeodomain) Domänen deutete darauf hin, dass „weibliche“ Varianten einen stärkeren destabilisierenden Effekt auf das Protein haben als „männliche“ Varianten. Als nächstes zeigten in vitro Überexpressionsanalysen, dass PHF6 mit „weiblichen“ Varianten in veränderter subzellulärer Proteinlokalisation, Aggregatbildung und stark reduzierten Proteinmengen resultierte. PHF6 mit pathogenen „männlichen“ Varianten hingegen verhielt sich ähnlich wie Wildtyp-PHF6. Daher könnte spekuliert werden, dass de novo Varianten im weiblichen Geschlecht schwerere Auswirkungen als die im männlichen Geschlecht identifizierten Varianten haben und so zur unterschiedlichen phänotypischen Ausprägung beitragen könnten. Weiterhin zeigte die ex vivo Analyse an Fibroblasten weiblicher Individuen einen Verlust des mutierten PHF6 Proteins, unabhängig vom Typ der untersuchten Variante (Missense, trunkierend, intragenische Duplikation). Dies deutet auf einen generellen Funktionsverlust-Mechanismus von PHF6 bei Frauen mit BFLS hin. Auf diese Beobachtung aufbauend habe ich mit Hilfe der CRISPR/Cas9 Technologie ein humanes, Neuronen-ähnliches PHF6 knockout (KO) Zellmodel hergestellt. Transkriptomanalysen dieser Zellen bestätigten eine Rolle für PHF6 in der transkriptionellen Regulation und in der Entwicklung und Differenzierung von Neuronen. Phänotypische Analysen der Zellen offenbarten tatsächlich Veränderungen im Neuritenwachstum und in der Anzahl der primären Neuriten. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von PHF6 beim multipolaren zu bipolaren Übergang der Neurone hin. Weiterhin zeigten die Zellen eine langsamere Proliferation und Migration, was auf eine mögliche Rolle für PHF6 in der neuronalen Entwicklung hindeutet. Diese Prozesse könnten daher im Rahmen des BFLS gestört sein und den kognitiven Phänotypen zugrunde liegen. Im zweiten Teil meiner Dissertation wurden Varianten in SCAF4 als ursächlich für eine Form der Entwicklungsstörung identifiziert. Durch internationale Kollaborationen sammelten wir Mutationsdaten sowie klinische Daten von neun Individuen mit pathogenen Varianten in SCAF4. Diese umfassten sieben trunkierende und zwei Spleiß-Varianten, von denen acht de novo auftraten. Phänotypische Merkmale beinhalteten unter anderem eine milde intellektuelle Entwicklungsstörung, eine stark verzögerte Sprachentwicklung, eine Epilepsie und Verhaltensauffälligkeiten. SCAF4 interagiert mit der RNA Polymerase II und spielt eine Rolle bei der korrekten transkriptionellen Termination durch die Verhinderung der Nutzung von alternativen Polyadenylierungs (PolyA)-Signalen. Sequenzierung der RNA aus Blut-Lymphozyten von betroffenen Individuen im Vergleich zu Kontrollen zeigte eine hohe Anzahl an differentiell regulierter Gene. Weiterhin hatten die Patienten ein ausgeprägt verändertes Transkriptions-Profil mit einer bevorzugten Expression von verkürzten Transkripten, entweder durch die Nutzung von alternativen PolyA-Signalen und/oder durch alternative Transkriptionsstarts. Dies weist darauf hin, dass SCAF4 nicht nur bei der transkriptionellen Termination, sondern auch beim Transkriptionsstart und anderen Schritten der mRNA-Prozessierung eine Rolle spielt. Zusätzlich führte ein Knockdown des SCAF4 Orthologs CG4266 in Drosophila melanogaster als Modellorganismus zu einer veränderten Morphologie neuromuskulärer Synapsen, einer Beeinträchtigung der neurologischen Gesamtfunktion und einer Beeinträchtigung der Lern- und Gedächtnisleistung. Dies korreliert mit der Beeinträchtigung der neuronalen Entwicklung und den kognitiven Einschränkungen bei Individuen mit pathogenen Varianten in SCAF4 und bestätigte SCAF4 als mit Entwicklungsstörungen assoziiertes Gen. Zusammengefasst konnten im Rahmen dieser Arbeit zum einen SCAF4 als neues Gen für Entwicklungsstörungen identifiziert und zum anderen neue Erkenntnisse über die Pathomechanismen des PHF6-assoziierten Borjeson-Forssman-Lehmann-Syndroms gewonnen werden. Weiterhin wurde die Rolle beider Gene in der funktionellen Einheit „Chromatin- und Transkriptions-Regulation“ näher beschrieben. Neurodevelopmental disorders (NDDs) are clinically and genetically extremely heterogeneous. Frequently, genes are affected whose products are linked in a common molecular network or pathway. One of these increasingly acknowledged molecular/functional modules is the regulation of chromatin and transcription-related processes. This thesis sheds light on two genes associated with NDDs which are involved in these processes, a) PHF6, a potential chromatin remodeler, in which pathogenic variants are associated with X-linked Borjeson-Forssman-Lehmann syndrome (BFLS), and b) SCAF4, a transcriptional regulator, which has not yet been associated with NDDs. In the first part of my thesis, I investigated the underlying molecular pathomechanisms of BFLS. Considering that phenotypical differences between affected males with inherited X-linked recessive variants and affected females with de novo variants in PHF6 are observed, I assessed the possible mechanism underlying these differences. Data-based modeling of variants located in the zinc finger domains indicated that “female” variants might have more severe effects on protein stability than “male” variants. Next, in vitro overexpression analysis revealed that mutant PHF6 with “female” variants resulted in altered subcellular PHF6 localization with formation of aggregates and strong reduction of protein levels, while mutant PHF6 with “male” variants behaved more similar to wildtype PHF6. Therefore, the hypothesis was brought forward that de novo variants found in females are more disruptive. Furthermore, ex vivo analysis of female patient fibroblasts revealed loss of mutant PHF6, independent from the type of variant (missense, truncating, intra-genic duplication), indicating a common loss-of-function mechanism in females with BFLS. Based on these observations, I constructed a human neuron-like PHF6 knockout (KO) cell model using CRISPR/Cas9. Transcriptome analysis of these cells confirmed a role for PHF6 in chromatin remodelling and additionally in neuron development and differentiation. Phenotypic analysis of PHF6 KO neuron-like cells revealed alterations in neurite outgrowth and in the number of primary neurites, possibly indicating a role for PHF6 in multipolar to bipolar transition of neurons. Furthermore, cells exhibited slower proliferation and migration, indicating a role for PHF6 in neuron development. These processes might therefore be altered in BFLS. In the second part of my thesis, variants in SCAF4 were identified as causative for a NDD. We collected mutational and clinical data from nine individuals with pathogenic variants in SCAF4, truncating and splice-site variants, eight of them occurring de novo. Most prominent phenotypic features included mild intellectual disability, severely delayed speech development, epilepsy and behavioural anomalies. SCAF4 interacts with RNA polymerase II and plays a role in correct transcriptional termination by preventing the usage of early polyadenylation (polyA) sites. RNA sequencing of patient blood lymphocytes revealed a broad deregulation of genes in affected individuals in comparison to controls, with a large number of aberrant, mostly shortened transcripts. This shift was either mediated by the usage of alternative polyA sites and/or alternative transcriptional start sites. This suggests a possible role for SCAF4 not only in transcriptional termination but also in transcriptional start site recognition and other mRNA processing steps. Furthermore, knockdown of the SCAF4 orthologue CG4266 in the model organism Drosophila melanogaster resulted in impaired morphology of neuromuscular junctions, impaired gross neurological functioning and impaired learning and memory performance. This is consistent with the neurodevelopmental phenotype and cognitive impairment in humans with SCAF4 loss-of-function variants and emphasizes SCAF4 as a new NDD associated gene. In summary, this thesis identified SCAF4 as a new NDD associated gene and provided new insights into the pathomechanisms of PHF6-associated Borjeson-Forssman-Lehmann syndrome. Furthermore, the role of both genes in the context of the functional module “regulation of chromatin and-transcription-related processes” was further described. |
