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Die Entwicklung der Muskulatur ist seit Jahrzehnten Gegenstand intensiver Forschungen in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. Dennoch gibt es noch viele offene Fragen zu beantworten. Um ein vollständigeres Bild dieses Entwicklungsprozesses zu erhalten, wählte ich in dieser Arbeit einen artenübergreifenden Ansatz. Zur Identifikation neuer Gene und Signalwege, die an der Myogenese beteiligt sind, nahm ich an dem genomweiten RNAi-Screen iBeetle im rotbraunen Reismehlkäfer Tribolium castaneum teil. Für die tiefergehende Analyse der gefundenen Kandidatengene wurde aufgrund der Vielzahl an vorhandenen genetischen Methoden Drosophila verwendet. Das erste Kapitel dieser Arbeit handelt vom iBeetle-Screen mit dem Hauptaugenmerk auf Muskelphänotypen und die Eingrenzung möglicher Kandidatengene. Ausgehend von 3500 gescreenten Genen und 126 Genen mit dokumentiertem Muskelphänotyp konnte ich in einem Rescreen die Muskeldefekte bei 29 von 52 getesteten Genen reproduzieren. Um Stamm-spezifische Defekte und off-target Effekte auszuschließen wurde mit den 15 interessantesten der 29 positiv getesteten Gene ein zweiter Rescreen durchgeführt. Von diesen Genen wurden sieben für weitere Analysen in Drosophila ausgewählt. Im zweiten Kapitel dieser Arbeit wird beleuchtet, ob Tribolium als zu Drosophila komplementäre Screening-Plattform genutzt werden kann. Diese wurde zur Identifizierung möglicher neuer Komponenten des Integrin-Signalwegs genutzt, der bei der Zell-Zell-Adhäsion eine wichtige Rolle spielt. Ist der Integrin-Signalweg gestört führt dies unter anderem zu einem Verlust der Zell-Zell-Adhäsion zwischen dem dorsalen und ventralen Flügelepithelium, wodurch sich im Flügel mit Flüssigkeit gefüllte Blasen bilden, sogenannte wing blister. Ich konnte erfolgreich demonstrieren, dass mehrere Gene, die in Tribolium nach ihrem knockdown einen wing blister Phänotyp zur Folge hatten, auch in Drosophila nach RNAi wing blister Phänotypen verursachen. Das letzte Kapitel widmet sich der Analyse des Hauptkandidatengens. In Tribolium resultierte der knockdown von nostrin in dünneren Muskeln, ein Phänotyp, der in Tribolium ebenfalls nach dem knockdown von bereits bekannten Genen, die an der Myoblastenfusion beteiligt sind, beobachtet werden kann. nostrin kodiert für ein Mietglied der F-BAR-Proteinfamilie, von der bekannt ist, dass sie die Biegung von Membranen fördern und mit Faktoren interagieren, welche die Umstrukturierung von Aktin regulieren. Beides sind Prozesse, die auch wichtige Aspekte bei der Myoblastenfusion darstellen. Meine Ergebnisse sprechen dafür, dass Nostrin in Drosophila während der Myoblastenfusion zusammen mit dem F-BAR-Protein Cip4 redundant wirkt, da der Verlust beider Proteine einen schwachen Fusionsdefekt in Embryonen zur Folge hatte, der in den jeweiligen Einzelmutanten nicht beobachtet werden konnte. Außerdem konnte ich zeigen, dass der Verlust von nostrin und cip4 in adulten Fliegen eine starke Störung in der Morphologie der longitudinalen viszeralen Muskulatur zur Folge hat, die nicht auf eine beeinträchtigte Myoblastenfusion zurückzuführen ist. In diesem Zusammenhang konnte ich außerdem zeigen, dass die Normalentwicklung der adulten longitudinalen Darmmuskeln offenbar über einen Zwischenschritt der Dedifferenzierunung und Fragmentierung in mononukleäre Myoblasten erfolgt, wobei die normale Redifferenzierung und Morphogenese nach erneuter Myoblastenfusion offenbar die Aktivitäten von nostrin und cip4 benötigt. Although muscle development in the fruitfly Drosophila melanogaster has been studied quite extensively in the last decades there still remain many open questions. In this work I chose an inter-species approach to gain a full understanding of this developmental process. I participated in the genome-wide RNAi screen iBeetle in the red flour beetle Tribolium castaneum to identify novel genes and signaling pathways involved in myogenesis. Because of the huge number of genetic tools available I used Drosophila for in-depth analysis of the newly identified genes. The first chapter of this thesis describes the iBeetle screen with the main focus of attention on muscle phenotypes and the selection of possible candidate genes. Starting from 3500 screened genes and 126 documented muscle phenotypes, I was able to reproduce the muscle phenotypes of 29 out of 52 genes I tested in a rescreen. A second rescreen was performed with the 15 most promising genes of the previously positive tested 29 genes to exclude strain-specific defects and off-target effects. Seven of these genes were selected for deeper analysis in Drosophila. The second chapter deals with the question of whether Tribolium can be used as a complementary screening platform to Drosophila. To address this issue the identification of candidates for new components of the integrin signaling pathway was used, which plays a major role during cell-cell-adhesion. Disruptions during integrin signaling lead to a loss of the cell-cell-adhesion between the dorsal and the ventral wing epithelium, which leads to liquid filled blisters on the wing surface, so called wing blisters. I was able to successfully demonstrate that several genes resulting in a wing blister phenotype after knockdown in Tribolium also lead to wing blisters in Drosophila after RNAi. The last chapter focuses on the analysis of my main candidate gene nostrin. In Tribolium the knockdown of nostrin results in thinner muscles, a phenotype commonly observed in Tribolium after knockdown of genes already known to be involved in myoblast fusion. nostrin encodes a protein of the F-BAR domain protein family, which are known to promote membrane curvature and to interact with actin remodeling molecules. Both of these processes are important aspects during myoblast fusion. My results indicate that in Drosophila Nostrin acts redundantly with the F-BAR protein Cip4 during myoblast fusion. The loss of both proteins results in a weak fusion defect during embryonic myogenesis, which can not be observed in the respective single mutants. Furthermore, I was able to show that the loss of nostrin and cip4 leads to a strong misalignment of the longitudinal visceral musculature in adult flies which can not be explained by a disrupted myoblast fusion. In this context I also was able to show that the development of the adult longitudinal visceral musculature in the wildtype seems to occur via an intermediate step of dedifferentiation and fragmentation into mononucleated myoblasts. The regular redifferentiation and morphogenesis after renewed myoblast fusion seems to be dependent on the activity of nostrin and cip4. |
