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2 Zusammenfassung 2.1 Hintergrund und ZieleDie Parkinson-Krankheit (PD) ist eine unheilbare, neurodegenerative Erkrankung, deren Prävalenz weltweit auf 315/100.000 Einwohner geschätzt wird. Motorische und nicht-motorische Symptome führen zu einem schweren und komplexen Krankheitsbild. Zentrales Element der Neurodegeneration ist der Untergang dopaminerger Neurone in der Pars compacta der Substantia nigra (SN). In der Folge kommt es zu einem Mangel an Dopamin (DA) im Striatum, womit man einen Großteil der motorischen Symptome erklärt. Daneben sind weitere Hirnregionen und Transmittersysteme, z.B. das Serotonin- (5-HT-) System, betroffen, die mit den nicht-motorischen Symptomen in Zusammenhang gebracht werden. Bedeutende histologische Kennzeichen von PD sind die Lewy-Körperchen, Einschlusskörper aus abnormen Filamenten, die sich vor allem in der SN ablagern. Diese Filamente bestehen überwiegend aus AlphaSynuklein (aSyn), einem kleinen, normalerweise löslichen Protein, das u.a. an der Regulation von synaptischer Aktivität und Neurotransmitter-Freisetzung (v.a. DA) beteiligt ist. Die Mehrzahl der PD-Fälle ist multifaktoriell bedingt, dabei konnten verschiedene risikomodifizierende Faktoren ausgemacht werden. So scheint PestizidExposition mit erhöhtem, Alkoholkonsum dagegen mit reduziertem PD-Risiko einherzugehen. Ein kleiner Teil der PD-Fälle ist direkt auf genetische Veränderungen zurückzuführen. Das zuerst entdeckte Beispiel ist eine Mutation des SNCA-Gens, das für aSyn kodiert: Ein einzelner Basenaustausch von Glycin zu Alanin an Position 209 des vierten Exons führt zu einer Substitution von Alanin durch Threonin an Position 53 (A53T). Mäuse, die humanes A53T-mutiertes aSyn (hA53T-aSyn) exprimieren, fungieren als Parkinson-Modell. Sie zeigen u.a. dysfunktionale Veränderungen des DA- und 5-HT-Systems. Neben der eigentlichen Parkinson-Symptomatik kommt es bei PD-Patienten gehäuft zu Suchterkrankungen. Im klinischen Alltag werden dabei alkoholbezogene Störungen interessanterweise auffallend selten beobachtet. Alkoholkonsum ist weltweit und in Deutschland weit verbreitet und mit enormen gesundheitlichen Risiken verbunden. Die Zahl der Alkoholabhängigen in Deutschland wird auf 1,9 Millionen geschätzt. An der Entstehung von Alkoholismus sind u.a. psychologische, soziale, genetische und neurobiologische Faktoren beteiligt. Auf neurobiologischer Ebene konnten als wichtigste beteiligte Neurotransmitter(-Systeme) identifiziert werden: Glutamat, Gamma-Aminobuttersäure, 5-HT und DA. Daneben scheinen u.a. der Endocannabinoid-Rezeptor CB1 und Opioide eine Rolle zu spielen. Von zunehmendem Interesse ist zudem SNCA bzw. aSyn, das bislang vor allem wegen seiner Rolle in der Pathogenese von PD bekannt ist. So wurde SNCA im Rahmen eines Convergent Functional Genomics-Ansatzes, der alle verfügbare Evidenz aus genomweiten Assoziationsstudien, Human- und Tierstudien auf GenEbene zu integrieren versuchte, als bedeutendstes Kandidatengen für Alkoholismus ausgemacht. Zwischen PD und Alkoholismus bestehen also Zusammenhänge: Alkoholkonsum könnte protektiv auf das Parkinson-Risiko wirken und PD-Patienten scheinen auffallend wenig Alkohol zu konsumieren. Zudem wurde SNCA neben seiner bekannten Rolle in der Pathogenese von PD als Top-Kandidatengen für Alkoholismus ausgemacht. Die genauen Beziehungen zwischen konkreten Veränderungen von SNCA bzw. aSyn und Alkohol-Konsumverhalten sind jedoch bislang unzureichend erforscht. Daher untersuchte diese Studie das Alkoholtrinkverhalten in einem hA53Tbasierten, transgenen Mausmodell für PD, im Speziellen für männliche Mäuse in fortgeschrittenem Alter, aber noch vor Entwicklung einer Parkinson-Symptomatik. In Anlehnung an die erwähnten Befunde stellten wir die Hypothese auf, dass diese transgenen Mäuse weniger Alkohol konsumieren würden als ihre Vergleichsgruppe. 2.2 Methoden Als Versuchstiere dienten heterozygote (het), transgene Mäuse (Anzahl (n) = 14) mit B6D2F1-Hintergrund, die hA53T-aSyn unter Kontrolle des Platelet Derived Growth Factor Beta-Promotors exprimierten, sowie ihre nicht-transgenen (non-tg) Wurfgeschwister (n=15), die Maus-Wildtyp-aSyn exprimierten. Die Tiere waren männlich, Alkohol-naiv und bei Versuchsbeginn zwischen 25 und 30 Wochen alt. Das Alkoholtrinkverhalten und ein möglicher Alkoholdeprivationseffekt (ADE) wurde unter Verwendung eines two-bottle free-choice drinking-Paradigmas untersucht. Den Tieren wurde Ethylalkohol in steigender Konzentration bis zu 16 % vol Alkohol und Wasser zur Wahl angeboten. Zur Ermittlung eines möglichen ADE folgten drei Zyklen des vorübergehenden Alkoholentzugs. In den letzten dieser Zyklen wurde eine Testung der Geschmackspräferenz mithilfe von Chinin-Lösung und Saccharose-Lösung integriert. Das konsumierte Volumen wurde täglich durch händisches Wiegen ermittelt. Die erhobenen Daten wurden mittels zweifaktorieller Varianzanalyse analysiert. Darauf folgten vorausgeplante Vergleiche mit Fisher’s Least Significant DifferenceTests, wenn nötig mit Bonferroni-Korrektur. Mit den Daten zur Geschmackspräferenz wurden Zweistichproben-t-Tests für unverbundene Stichproben durchgeführt. Als Signifikanzniveau wurde 0,05 gewählt. 2.3 Ergebnisse und Beobachtungen Der Alkoholkonsum der het-Mäuse lag im Bereich der Zieldosis von 16 % vol signifikant niedriger als in der Vergleichsgruppe. Kein signifikanter Unterschied ergab sich in der Präferenz für Alkohol gegenüber Wasser und in keiner Gruppe konnte ein ADE beobachtet werden. Im Rahmen der Testung der Geschmackspräferenz zeigten die het-Mäuse signifikant niedrigere Präferenz für 5-prozentige Saccharose-Lösung, wobei die Präferenz beider Gruppen deutlich über 50 % lag. Kein wesentlicher Unterschied bestand bei der Präferenz für Chinin-Lösung, wobei die Präferenz beider Gruppen für 20 mg/dl Chinin-Lösung deutlich unter 50 % lag. 2.4 Schlussfolgerungen Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese: Die hA53T-aSyn exprimierenden hetMäuse fortgeschrittenen Alters konsumierten im Bereich der Zieldosis von 16 % vol signifikant weniger Alkohol. Beide Gruppen bevorzugten Saccharose-Lösung bzw. mieden Chinin-Lösung gegenüber Wasser, zeigten also eine intakte Geschmackspräferenz. Die niedrigere Präferenz der het-Mäuse für 5-prozentige Saccharose-Lösung kann als Hinweis auf Anhedonie, möglicherweise im Zuge einer beginnenden Parkinson-Symptomatik, gedeutet werden. Die Resultate passen zu Beobachtungen, wonach PD-Patienten auffallend wenig Alkohol konsumieren. Fokussiert man die zugrunde liegende A53T-Mutation, so ist das Ergebnis ein weiterer Hinweis, dass SNCA bzw. aSyn auch in der Pathogenese von Alkoholismus relevant ist. Die dahinterstehenden Zusammenhänge und Mechanismen sind bislang noch nicht ausreichend verstanden. Für das DA- und 5-HT-System gilt eine wichtige Rolle sowohl bei PD als auch Alkoholismus als gesichert. Auch bei hA53T-aSyn exprimierenden Mäusen konnten weitreichende Veränderungen in diesen Systemen nachgewiesen werden. Entsprechend sind sie für die weitere Forschungsarbeit von vorrangigem Interesse. Diese Studie liefert weitere Evidenz, dass SNCA bzw. aSyn nicht nur in der Ätiologie und Pathophysiologie von PD, sondern auch in der Pathogenese von Alkoholismus relevant ist. Die weitere Erforschung verschiedener Veränderungen von SNCA und ihres Einflusses auf das Alkoholkonsumverhalten könnte zu einem besseren Verständnis der Entstehung von Alkoholismus auf neurobiologischer Ebene beitragen, und helfen, die auf klinischer Ebene beobachteten komplexen Zusammenhänge zwischen PD und Alkoholismus zu verstehen. 1. Abstract 1.1. Objectives Parkinson’s Disease (PD) is an incurable, neurodegenerative disease with an increasing prevalence currently estimated at 315/100.000 people worldwide. Motor and non-motor symptoms constitute a severe and complex disease pattern which considerably affects quality of life. Pivotal feature of neurodegeneration is the loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra (SN) pars compacta. Subsequently, there is a lack of dopamine (DA) in the striatum, which is held responsible for the development of motor symptoms. Besides, there are more brain regions and neurotransmitter systems involved, e. g. the serotonin (5-HT) system. These, for their part, are thought to be associated with non-motor symptoms. Important histological features of PD are the Lewy bodies, inclusion bodies consisting of abnormal filaments that are mainly located in the SN. These abnormal filaments are predominantly composed of alpha-Synuclein (aSyn), a small and normally soluble protein, which can be found in great numbers in synaptic vesicles and nerve endings. Physiologically, aSyn is involved in the regulation of synaptic activity and neurotransmitter release, especially regarding DA. Most PD cases are caused multifactorially and several risk modifying factors have been identified. For example, current studies suggest that exposure to pesticides may increase, whereas alcohol consumption may reduce the risk for PD. A small number of PD cases can be traced back to specific genetic mutations. The first one to be discovered was a mutation in the SNCA gene encoding for aSyn: a single base exchange from glycine to alanine at position 209 of the 4th exon leads to a substitution of alanine by threonine at position 53 (A53T). Mice expressing human A53T-mutant aSyn (hA53T-aSyn) serve as PD model and display dysfunctional changes in DA, 5-HT, and other neurotransmitter systems. Mouse models based on hA53T-aSyn expression seem to reproduce early as well as late symptoms of PD fittingly. Besides the actual parkinsonian symptoms, PD patients often display addictive behaviour, especially when treated with dopaminergic medication. Interestingly, observations from everyday clinical practice suggest that alcohol-related disorders are comparatively rare among PD patients. Alcohol consumption is very common around the world and especially in Germany. But it is accompanied by enormous risks to health. In Germany there are approximately 1.9 million alcohol addicts and every day about 200 people die from direct or indirect consequences of immoderate alcohol use. Among others, psychological, social, genetic, and neurobiological factors contribute to the development of alcoholism. On the neurobiological level, several neurotransmitters and their systems have been shown to be involved. The most important ones are glutamate, gamma-aminobutyric acid, 5-HT and DA. Besides, the cannabinoid receptor CB1 and opioids seem to play a role as well. In addition, SNCA respectively aSyn, so far primarily known for its contribution to the pathogenesis of PD, is of increasing interest. For example, mice with a spontaneous deletion of the SNCA gene displayed higher alcohol consumption. As part of a Convergent Functional Genomics (CFG) approach, which aims to integrate evidence from all accessible genome-wide association studies, human and animal studies at the gene level, SNCA ultimately was identified as the top candidate gene for alcoholism. Taken together, there are relationships between PD and alcoholism: alcohol consumption might reduce risk for PD and PD patients appear to consume noticeably little alcohol. Furthermore, in addition to its well-known role in the pathogenesis of PD, SNCA was identified as the top candidate gene for alcoholism. The interactions between specific changes in SNCA or aSyn respectively on the one hand and alcohol consumption on the other hand have so far been insufficiently researched. Therefore, this study examined the alcohol consumption behaviour in a hA53T-based, transgenic mouse model for PD, particularly in male mice of advanced age but still without parkinsonian symptoms. In line with the afore-mentioned findings, we hypothesized that the transgenic mice would consume less alcohol than their controls. 1.2 Design and Methods The animals used in this study were heterozygous (het) transgenic mice (number (n) =14) of B6D2F1-background that expressed hA53T-aSyn under control of the platelet-derived growth factor beta promoter, as well as their non-transgenic (nontg) littermates (n =15). Animals were male, alcohol-naive and, at the beginning of the study, between 25 and 30 weeks old. Alcohol drinking behaviour in het mice and non-tg controls was investigated according to a two-bottle free-choice drinking paradigm. Mice were single-housed in standard single-cages with constant access to standard rodent food and two drinking bottles. The animals had the choice between increasing doses of ethyl alcohol (2, 4, 8, 12, 16 % vol) or water. This was followed by a three-time cycle of withdrawal and reinstatement to investigate a possible Alcohol Deprivation Effect (ADE). In the last of these cycles a taste preference test with sucrose (0,5 % and 5 %) and quinine (2 mg/dl and 20 mg/dl) solution was integrated. The consumed volume was measured by manual weighing on a daily basis. Data was analysed using two-way analysis of variance followed by pre-planned comparisons using Fisher’s least significant difference tests with Bonferroni-correction when appropriate. For the analysis of taste preference data, two-sample t-tests were performed. A significance level of p < 0.05 was chosen. 1.3 Observations and Results Het mice showed significantly lower alcohol consumption than their controls referred to the target dose of 16 % vol alcohol. There was no significant difference regarding alcohol preference over water and no ADE could be observed. In terms of taste preference het mice displayed a significantly lower preference for 5 % sucrose over water, although the preference for sucrose in both groups was clearly over 50 %. No essential difference was found concerning preference for quinine with both groups displaying values clearly below 50 % for 20 mg/dl quinine. 1.4 Conclusions The results support the working hypothesis: het mice of advanced age expressing hA53T-aSyn consumed less alcohol referred to the target dose of 16 % vol alcohol. Both groups preferred sucrose and avoided quinine solution thus indicating intact taste preference. The comparatively lower preference for 5 % sucrose solution among het mice could be a sign of anhedonia, possibly due to the onset of PD symptoms. These results are in line with clinical observations according to which PD patients consume noticeably little alcohol. With focus on the A53T mutation underlying the model, the results provide further evidence that SNCA or aSyn is respectively involved in the pathogenesis of alcoholism. The precise relationships and the mechanisms behind them are not yet sufficiently understood. But for the DA and 5-HT system, an important role in pathophysiology is considered to be certain in both PD and alcoholism. Extensive changes in these two systems have been demonstrated in mice expressing hA53T-aSyn. Accordingly, they are of superior interest for further research. Taken together, this study provides further evidence that SNCA and aSyn are relevant not only in the etiology and pathophysiology of PD, but also in the pathogenesis of alcoholism. Further research into specific changes in SNCA and their consequences for alcohol consumption behaviour could contribute to a better understanding of the development of alcoholism at the neurobiological level, and help to understand the complex relationships between PD and alcoholism observed at the clinical level. |
