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The recombinant immunotoxin Moxetumomab pasudotox (Moxe) consists of a fragment of Pseudomonas exotoxin A and the variable fragment (Fv) of a monoclonal anti-CD22 antibody. Moxe shows substantial activity against various B-cell malignancies in vitro. However, there is very little activity against mantle cell lymphoma or pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia (ALL) in patients. This is the reason for ongoing research in optimizing immunotoxin-based therapy. Previous work by the group of Dr. Müller (University Hospital Erlangen, Medical Clinic 5) showed that the combination treatment with Moxe and 2-Deoxyglucose (2-DG) has a synergistic effect on the cell death of various B-cell lymphomas in vitro. 2-DG is a glucose analogue, which, on the one hand, non-competitively inhibits glycolysis and on the other hand, competitively inhibits the N glycosylation of proteins. The latter leads to the accumulation of misfolded proteins and the activation of the "Unfolded Protein Response" (UPR). The aim of this work is to identify the metabolic pathway involved in the synergism and to characterize the underlying mechanism. For the in vitro experiments, human Burkitt’s lymphoma cell lines CA46 and Ramos, as well as the human mantle cell lymphoma JeKo-1 were treated with different concentrations and combinations of the reagents Moxe, 2-DG, 3 Bromopyruvate, Metformin, Pyruvate, Ribose, Tunicamycin and Mannose. The effects on cell death, proliferation and UPR were investigated by means of flow cytometry, colorimetric absorption measurement, western blot, and reverse transcription PCR. Results The combination treatment with 2-DG and Moxe led to a synergistic increase in cell death of B-cell lymphoma cells in vitro. 2-DG induced UPR in the examined cell lines which was shown by an increased expression of the chaperone BiP (Binding immunoglobulin Protein). The additional treatment with Moxe inhibited the expression of BiP after 2-DG treatment. CHOP (C/EBP-homologous protein), a marker for UPR-mediated apoptosis, remained strongly expressed even after the additional treatment with Moxe. 2-DG induces the expression of the chaperone BiP, which promotes the UPR as a rescue mechanism and thus, prevents cell death to a certain extent. Moxe inhibits the production of protective BiP, which increases the cytotoxic effect of 2 DG. This synergistic reinforcement could form the basis for further research in order to develop new antibody-based therapy options for patients with B-cell malignancies. Das rekombinante Immunotoxin Moxetumomab pasudotox (Moxe) besteht aus einem Fragment des Pseudomonas Exotoxin A und dem variablen Fragment eines monoklonalen anti-CD22-Antikörpers. In vitro wirkt Moxe effektiv gegen verschiedene B-Zell-Malignome. Im Patienten zeigt sich jedoch keine relevante Aktivität gegen Mantelzell-Lymphome oder pädiatrische B-Zell akut lymphatische Leukämien (ALL), weshalb aktuell an einer Optimierung der antikörperbasierten Therapie gearbeitet wird. Vorangegangene Arbeiten der Arbeitsgruppe um Dr. Müller (Uniklinikum Erlangen, Medizinische Klinik 5) konnten zeigen, dass die Kombinationsbehandlung mit Moxe und 2 Deoxyglucose (2-DG) synergistisch auf den Zelltod verschiedener B-Zell-Lymphome in vitro wirkt. 2 DG ist ein Glucose-Analogon, welches zum einen nicht kompetitiv die Glykolyse und zum anderen kompetitiv die N-Glykosylierung von Proteinen hemmt. Durch Letzteres kommt es zur Anreicherung von fehlgefalteten Proteinen und zur Aktivierung der „Unfolded Protein Response“ (UPR). Ziel dieser Arbeit ist es den am Synergismus beteiligten Stoffwechselweg zu identifizieren und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen und näher zu charakterisieren. Für die in vitro Experimente wurden die humanen Burkitt-Lymphom-Zelllinien CA46 und Ramos, sowie das humane Mantelzelllymphom JeKo-1 mit unterschiedlichen Konzentrationen und Kombinationen der Reagenzien Moxe, 2 DG, 3-Bromopyruvat, Metformin, Pyruvat, Ribose, Tunicamycin und Mannose behandelt. Die Auswirkungen auf den Zelltod, auf die Proliferation und auf die UPR wurden mittels Durchflusszytometrie, kolorimetrischer Absorptionsmessung, Western-Blot und Reverse Transkriptase-PCR untersucht. Ergebnisse und Beobachtungen In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kombinationsbehandlung mit 2 DG und Moxe zu einem synergistischen Anstieg des Zelltods von B Zell Lymphom Zellen in vitro führte. 2-DG induzierte in den untersuchten Zelllinien UPR, was sich in der vermehrten Expression des Chaperon-Proteins BiP (Binding immunoglobulin Protein) zeigte. Die Zusätzliche Behandlung mit Moxe inhibierte die Expression von BiP nach 2-DG Behandlung. CHOP (C/EBP-homologous protein), ein Markerprotein für UPR vermittelte Apoptose, blieb auch nach der zusätzlichen Behandlung mit Moxe verstärkt exprimiert. 2-DG induziert die Expression des Chaperons BiP, welches die UPR als Rettungsmechanismus fördert und damit den Zelltod zu einem gewissen Teil verhindert. Moxe hemmt die Produktion des protektiven BiP, wodurch die zytotoxische Wirkung von 2-DG verstärkt wird. Diese synergistische Verstärkung könnte in Zukunft die Grundlage für weitere Forschung bilden, um neue antikörperbasierte Therapieoptionen für Patienten mit B-Zell-Malignomen zu entwickeln. |
