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Eine Koinfektion von HIV-Patienten mit dem nicht-pathogenen GB Virus C (GBV C) äußert sich durch deutlich bessere Überlebenschancen und eine verlangsamte Progression zu AIDS. Frühere Studien zeigten einen deutlichen Einfluss des GBV-C E2-Glykoproteins sowie des Nichtstruktur-Proteins (NS) 5A auf das HIV-Entry. In der vorliegenden Arbeit sollte sowohl der Einfluss der GBV-C Nichtstruktur-Proteine auf die HIV 1 Replikation als auch der HIV-inhibitorische Mechanismus des E2-Proteins untersucht werden. Im ersten Teil wurde mit Hilfe des Tet-Off-Systems die Einwirkung der GBV-C Proteine NS3, NS4A und NS5A auf die HIV 1 Replikation bestimmt. Dabei konnte die HIV hemmende Wirkung von NS3 identifiziert und von NS5A bestätigt werden, wobei das NS4A-Protein keinen Einfluss auf die HIV 1 Replikation zeigte. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte mit einem Virus-Zell-Fusionsassay eindeutig gezeigt werden, dass sowohl das GBV-C E2-Protein als auch vom E2 N Terminus abgeleitete Peptide (P4-7 und P6-2) den HIV-Eintritt in die Zielzelle unterdrücken. Des Weiteren führten Infektionskinetiken und diverse Bindungsstudien zu der Erkenntnis, dass hierbei späte Entry-Schritte nach der (Ko-)Rezeptorbindung, wie z.B. die Fusion der Virus- mit der Zellmembran, beeinflusst werden. Infektionsassays und weitere Bindungsstudien ließen erkennen, dass die E2 Peptide direkt mit HI Virionen und hier insbesondere mit den gp120-gp41 HIV Glykoproteinen interagieren. Weitere Kompetitionsstudien sowie direkte Bindungsassays führten letztendlich zur Identifizierung des Disulfid-Loops des HIV 1 gp41-Proteins als spezifischer Interaktionspartner des E2 Proteins. Dabei erwiesen sich sowohl Cysteine im Disulfid-Loop als auch im E2 N Terminus als essentiell. Unabhängig davon konnte durch bioinformatische Analysen eine Sequenzähnlichkeit zwischen den N Termini von HIV 1 gp120 und GBV-C E2 aufgedeckt werden. Literaturrecherchen belegen, dass die N- und C Termini von gp120 unter anderem mit dem Disulfid-Loop von gp41 interagieren, um die dynamische nicht-kovalente Verbindung zwischen gp120 und gp41 zu gewährleisten. Demzufolge kann geschlossen werden, dass die N-terminalen E2 Peptide bzw. der N Terminus des E2 Proteins den gp120 N Terminus von HIV 1 imitiert und somit in der Lage ist mit dem gp41-Disulfid-Loop zu interagieren. Dadurch wird wahrscheinlich das gp120-gp41 Interface gestört und die Fusion der Virus- mit der Zellmembran unterbunden. Struktur-Vorhersagen der E2 Ektodomäne lassen vermuten, dass der E2 N Terminus (AS 1 75) unstrukturiert vorliegt und somit flexibel genug ist den Disulfid-Loop zu erreichen. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass vom GBV C E2 abgeleitete cysteinhaltige Peptide in der Lage sind den gp41-Disulfid-Loop zu binden und die HIV-Fusion zu unterdrücken; diese Erkenntnis kann zur Entwicklung neuer HIV 1 Entry-Inhibitoren beitragen. HIV-1 patients benefit from a coinfection with the non-pathogenic GB Virus C (GBV-C), since HIV-positive individuals with long-term GBV-C viraemia show distinct better survival rates and decelerated progression to AIDS. Former studies observed a significant impact of the GBV C E2 glycoprotein and the non-structural protein (NS) 5A on HIV entry. In the present thesis the effect of GBV C non-structural proteins on HIV 1 replication as well as the inhibitory mechanism caused by the E2 protein was analyzed. In the first part the tet-off system was used to study the influence of the GBV C proteins NS3, NS4A and NS5A on HIV 1 replication. Thereby, an HIV-inhibitory effect of NS5A and NS3 could be either approved or identified, whereas the NS4A protein showed no influence on HIV replication. In the second part of the thesis the inhibition of HIV 1 entry by the GBV C E2 protein and E2 derived N-terminal peptides (P4 7, P6 2) was clearly demonstrated using a virus-cell-fusion assay. In addition infection kinetics and binding assays verified the impact on late entry steps after coreceptor binding such as fusion of the virus with the cell membrane. Further infection and binding assays led to the finding that E2 peptides interact directly with the gp120-gp41 glycoproteins of the HI virions. Additional competitive and direct binding assays identified the HIV 1 gp41 disulfide loop as the specific interaction partner of the E2 protein. For this interplay cysteine residues in the disulfide loop as well as in the E2 N terminus are essential. Independently from these findings, a sequence similarity between the N-termini of the HIV 1 gp120 and the GBV C E2 proteins was detected by bioinformatical analyses. It is believed that the gp120 N- and C-termini primarily interact with the gp41 disulfide loop to allow the dynamic and non-covalent binding of gp120 and gp41. Accordingly, we propose that N-terminal E2 peptides or the E2 N-terminus, respectively, may mimic the HIV 1 gp120 N-terminus which may enable the interaction with the gp41 disulfide loop. Possibly, this may lead to the disruption of the gp120-gp41 interface and the prevention of the fusion process of the viral with the cellular membrane. Protein structure predictions of the E2 ectodomain indicate that the E2 N-terminus (AS 1 75) seems to be unstructured and flexible which might favor the interaction with the disulfide loop. In summary, in this doctoral thesis it was shown that GBV C E2-derived cysteine-containing peptides are able to bind the gp41 disulfide loop and to inhibit the HIV 1 fusion process; a finding that could lead to the development of new HIV 1 entry inhibitors. |
