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C. albicans ist der bedeutendste humanpathogene Pilz. Er besitzt eine Vielzahl an Virulenzfaktoren, mit denen er sich spezifisch an verändernde Bedingungen im Wirt anzupassen vermag. Die Virulenzfaktoren werden in einem komplexen Netzwerk aus verschiedenen Signaltransduktionswegen reguliert. Hierbei hat der Transkriptionsfaktor Tec1p eine wichtige Bedeutung, da er für die Ausbildung von Hyphen sowie die damit verbundenen Expression von wichtigen Virulenzfaktoren benötigt wird. Tec1p gehört zur Familie der TEA/ATTS-Transkriptionsfaktoren, die sich durch die hoch konservierte TEA-DNA-Bindedomäne (TEAD) auszeichnet. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Beziehungen zwischen Struktur und Funktion des Tec1 Proteins aufgeklärt werden, um den Mechanismus der Tec1p-abhängigen Genregulation zu charakterisieren. Hierzu wurde der Transkriptionsfaktor auf Proteinebene bezüglich seiner DNA-Bindefähigkeit, seiner Genaktivierungsfähigkeit und der Interaktion mit anderen Proteinen näher untersucht. Die TEAD der TEA/ATTS-Transkriptionsfaktoren vermittelt die Bindung an ein definiertes DNA-Sequenzmotiv, der „TEA consensus sequence“ (TCS). Diese Sequenz ist in den Promotoren aller bekannter Tec1p-abhängig induzierter Gene zu finden. In EMSA-Studien konnte für Tec1p die spezifische DNA-Bindung an die TCS sowie an leichte Variationen des Motivs gezeigt werden. Zusätzlich wurde eine Beeinflussung der Protein-DNA-Interaktion durch den C-terminalen Bereich des Transkriptionsfaktors nachgewiesen. Während die Deletion der letzten 105 Aminosäuren zu einer Erhöhung der DNA-Bindeaffintität führte, war diese bei Deletion der Aminosäuren 244-637 völlig aufgehoben. Der Einsatz von GAL4-DB-Tec1-Fusionen in S. cerevisiae wies Tec1p eine autonome Transkriptions-aktivierungsaktivität zu, die sich auf mehrere N- und C-terminal der TEAD liegende Bereiche des Proteins verteilt. Interaktionspartner von Tec1p für eine kooperative Genaktivierung konnten bei der Durchmusterung einer Hyphen-cDNA-Bank mit den Tec1-Fusionen nicht identifiziert werden. In Immunoblot-Analysen von Tec1p aus C. albicans mit dem durch genetische Immunisierung hergestellten anti-Tec1p-Antiserums wurde für Tec1p eine Doppelbande um 100 kDa statt der theoretischen Molekularmasse von 81 kDa detektiert. Mit dem konstruierten C. albicans-Stamm mit konstitutiver TEC1-Expression konnte zudem gezeigt werden, dass die erhöhte Molekülmasse von Tec1p nicht von den verwendeten Hefe- und Hyphenwachstum-favorisierenden Anzuchtbedingungen beeinflusst wurde. Das Laufverhalten lässt sich vermutlich auf posttranslationale Modifikationen von Tec1p zurückführen. Nach diesen Ergebnissen ist für Tec1p eine direkte TCS-vermittelte Genaktivierung für die Regulation der Tec1p-abhängig induzierten Gene am wahrscheinlichsten. Dennoch ist nicht ausgeschlossen, dass Tec1p auch in anderen Mechanismen der Genregulation eine Rolle spielt. C. albicans is one of the most important fungal human pathogens. It possesses a variety of mechanisms to adapt specifically to changing conditions in the host environment. These virulence factors are regulated by a complex network of different signal transduction ways. In this network the transcription factor Tec1p is of significant importance. It is required for the developement of hyphae and the associated expression of important virulence factors. Tec1p belongs to the protein family of TEA/ATTS transcription factors. These proteins share a highly conserved TEA DNA-binding domain (TEAD) which mediates the binding to the conserved DNA binding motif, the TEA consensus sequence (TCS). In this work the structural and functional relationships of the Tec1-protein were investigated to characterise the Tec1p-depending mechanism of gene regulation. Therefore, the DNA-binding ability, the gene activation function and the interaction with other proteins was investigated on the protein level. The TEAD of the TEA transcription factors mediates the binding to the conserved DNA binding motif, the TEA consensus sequence (TCS). This sequence occurs in every promotor region of all known Tec1p-dependent induced genes. DNA-binding studies confirmed the specific DNA-binding of Tec1p to the TCS as well as to variations of this motif with single nucleotide exchanges. In addition to the TEAD, the C-terminal region of Tec1p from amino acid 244 to 637 was required for the DNA-binding. Furthermore, the deletion of amino acid 637 to 743 enhanced the binding affinity. By using GAL4-DB-Tec1 fusions in S. cerevisiae, Tec1p exhibited a autonomous transcription activation activity, which is located in several N- and C-terminal regions of the protein. Interaction partners of Tec1p for a cooperativ gene activation couldn’t be identified by screening a hyphal cDNA-bank using the Tec1-fusions. In immunoblot-analysis Tec1p expressed in C. albicans was deteceted using anti-Tec1p antiserum produced by genetic immunization. A 100 kDa double band was deteced instead of the expected band with a theoretically molecule mass of 81 kDa. Additionally, the constructed C. albicans strain with constitutive TEC1 expression showed that the increased molecule mass was not influenced by the yeast or hyphal growth conditions. The increased protein mass presumably results from posttranscritpional modifications of Tec1p. Regarding these results, Tec1p is likely to regulate the Tec1p-dependent induced genes by direct TCS-mediated gene activation. Yet it is not excluded that Tec1p is also involved in other mechanisms of gene regulation. |
