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Auf Grund sinkender Zahlen neu zugelassener Medikamente setzt ein Umdenken in der Wirkstoffforschung ein. Ein Trend geht hierbei zur Intensivierung von High‐Content‐Screening Verfahren. Durch den Einsatz lebender Zellkulturen ist eine Target‐Identifizierung nachranging und es können gleichzeitig mehrere Zielstrukturen mit einem Wirkstoffkandidaten angesprochen werden. Komplett automatisierte Zellkulturplattformen sind erhältlich, jedoch auf Grund der Kosten und Komplexität nicht für alle Labore ökonomisch sinnvoll einzusetzen. Diesen Bedarf versuchen neu entwickelte Systeme zu decken. Dabei ist es ein Ansatz, existierende Strukturen dieser Labore zu nutzen und somit Inkubator taugliche Kleinst‐Mikroskope zu konzipieren. Das von der Bayerischen Forschungsstiftung geförderte Projekt „COSIR“ greift diese Thematik auf. Ziel des Projektes ist die Entwicklung eines Inkubator‐tauglichen Mehrkanal‐Mikroskops, welches darüber hinaus mit Sauerstoff und pH‐Sensoren ausgestattet ist. Um mögliche Applikationen eines solchen COSIR‐Gerätes aufzuzeigen, werden für diese Arbeit zwei Arbeitsschwerpunkte gewählt und durch weiterführende analytische und instrumentelle Methoden in den Labor‐Alltag integriert. Zum einen werden Medienvariationen an verschiedenen Zelllinien und zum anderen exemplarische Wirkstoffscreenings durchführt, um die grundsätzliche Eignung zu belegen. Thematisch orientiert sich das an der aktuellen Diskussion des Warburg‐Effektes. Hiervon lassen sich gemäß der Hypothese metabolische Phänotypen ableiten, die sich nach oxidativen und proliferativen Typen unterscheiden lassen. Gemäß des Warburg‐Hypothese verhalten sich immortalisierten Krebszelllinien stark proliferativ. Dies äußert sich durch eine starke Korrelation des beobachteten Wachstums mit dem gemessenen Glucoseverbrauch und der entsprechenden Laktat‐Bildung. Es kann hier gezeigt werden, dass diese Messwerte indirekt über den Sauerstoffbedarf einer Zelle und deren Ansäuerungsverhalten abgeleitet werden können. Denn es ergibt sich für viele der eingesetzten Zelllinien ein Zusammenhang zwischen der oxidativen Phosphorylierung und dem gemessenen Partialdruck. Eine Ausnahme bilden Zellen, welche einen starken extrazellulären Sauerstoffbedarf über den PMET (Plasma Membrane Electron Transport) zeigen. Ebenso ergibt sich ein tendenzieller Zusammenhang zwischen der Ansäuerungsrate und der daraus resultierenden Laktatbildung über den zugehörigen Protonen‐Symport. Es kann gefolgert werden, dass die Zellen des proliferativen Typs ein sehr starkes Wachstum bei hohem Substratverbrauch zeigen. Entsprechend der notwendigen schnellen NADH‐Regenerierung wird Laktat gebildet. Oxidative Phänotypen zeigen kein bzw. ein geringes Wachstum, wobei der Sauerstoffbedarf pro verbrauchtes Substrat erhöht ist. Das lässt den Schluss einer gesteigerten Nutzung der Atmungskette zu. Die variablen Größen der Medienoptimierung sind Glutamin und FKS in verschiedenen Basismedien. Eine Erhöhung der Glutamin‐Konzentration bedingt zunächst eine Steigerung der Wachstumsrate. Durch weitere Erhöhung dieser Aminosäure tritt eine Minderung ein, was auf das Folgeprodukt Ammonium zurückzuführen ist. Da Glutamin oft als Laktat ausgeschleust bzw. als Bausteinmolekül benötigt wird, führt eine Erhöhung in vielen Fällen zu einer gesteigerten PCD bzw. zu einem geringeren pHmin, wodurch die Versuche stimmig mit der Literatur sind. Durch die gezielte Beeinflussung des Metabolismus ist es möglich einzelne Sensoren des COSIRSystems gezielt anzusprechen. So zeigen die Ergebnisse eine erhöhte Ansäuerung, wenn die Kultur unter dem Einfluss von Kobalt steht und Hypoxie‐ähnliche Mechanismen ausgelöst werden. Durch die Anwendung von Ionomycin wird die Stoffwechselleistung durch Steigerung des intrazellulären Calciums erhöht. Die anzunehmende Ursache liegt in der Calcium‐Abhängigkeit von den Dehydrogenasen des Citratzyklus. Eine übermäßige Steigerung des Ca2+ führt zum induzierten Zelltod, welcher ebenso nachgewiesen worden ist. Die Hemmung der individuellen Komplexe der Atmungskette wirkt sich auf die gemessene Sauerstoffaufnahmerate (OUR) aus. Durchflusszytometrische Methoden zeigen zudem die Initiierung Apoptose‐bezogener Signalkaskaden. Hierdurch kann Oligomycin weiter charakterisiert und zur Beeinflussung von Stoffwechselwegen herangezogen werden. Die Zelle wird durch die inhibierte Atmungskette bspw. zur Energiegewinnung über die Glykolyse gezwungen. Das beeinflusst den ATP‐Level der Zellen in einer frühen Phase nach der Wirkstoffgabe. Eine eigens für die Untersuchung von Hypoxie‐Markern entwickelte LC/MSMethode zeigt, dass Oligomycin zwar die Zelle inhibiert, jedoch keine typische (gesteigerte) Hypoxie auslöst. Denn bspw. der Umsatz von Hypoxanthin zu Harnsäure bleibt intakt. Aus dem projektierten Aufbau haben sich für das Live‐Cell‐Imaging Herausforderungen ergeben. Es wird ausschließlich auf durchlichtmikroskopische Techniken mit einer einfachen Optik zurückgegriffen. Somit stehen der Auswertung ausschließlich Hellfeldbilder zur Verfügung. Eine Motivation dieser Arbeit ist es gewesen, Möglichkeiten zu entwickeln, welche biologischen Daten aus den vorliegenden Bilddaten erhoben werden könnten. Dabei zeigt sich, dass durch die Auswertung von Zellform und Zelldistanz (Einzelzell‐, Monolayer‐ und Agglomerations‐Charakteristikum) interessante Aspekte extrahiert werden können. Diese lassen sich mit den Wachstumsphasen und wichtigen Eckdaten der Medien‐ und Zellanalytik kombinieren. In einigen Fällen ähnelt das gemessene Agglomerat‐Charakteristikum den Vitalitätsdaten. Zwar sind die absoluten Daten unterschiedlich, doch besitzen die zeitlichen Änderungen Kohärenz. Somit können auffällige Zeitpunkte in Verbindung mit wirksamen Konzentrationen identifiziert und in der Folge der weiterführenden Analytik zugeführt werden. Somit sind in dieser Arbeit relevante Beispielfälle dargelegt, die die Tauglichkeit dieser Sensor‐Kombination belegen und zur weiteren Entwicklung im Bereich der Automatisierung motivieren. Ein für das HCS wichtiger Aspekt ist die Merkmals‐Extraktion aus Mikroskop‐Bildern. Hier könnten zukünftige Arbeiten die Datenverarbeitung intensivieren. Due to the fact that the quantity of newly approved drugs is decreasing, rethinking in drug discovery is in discussion. One tendency is to intensify the High‐Content‐Screening‐approach. Through application of living cells target‐identification is subordinated and it is additionally possible to address more than one target with one drug candidate. Completely automated cell culture systems are available; however they are expensive und very complex therefore being uneconomical for some laboratories. Newly engineered systems try to cover the demand. One approach is to use the existing infrastructure of a lab and to develop small‐scale microscopes to run inside an incubator. The project “COSIR”, which was founded by the Bavarian Research Foundation, follows this idea. It aims to build an incubator‐suitable multichannel microscope, which is additionally equipped with oxygen and pHsensors. Two possible application fields for such a COSIR‐module were selected as a main focus for this thesis. First, suitability of the designed system for the media optimization was examined. Next, its application for drug screening was tested. Moreover, these works were integrated in daily lab routine by expending the analytical and instrumental methods. The work presented here was based on current discussion of Warburg’s effect. According to this hypothesis different metabolic cell phenotypes could be deflected. Hence oxidative and proliferative phenotypes are considered. Referred to Warburg’s effect immortalized cancer cell lines are of a proliferative type. This is expressed by the strong correlation of observed growth, glucose consumption and resulting lactate production. Proof can be provided that these observations are linked to oxygen demand of cells and their acidification rate, which can be shown here. There is a strong relationship between the oxidative phosphorylation and oxygen partial pressure. One exception is delivered by cells, which provide a large extracellular oxygen usage by PMET (Plasma Membrane Electron Transport). Furthermore lactate exclusion tends to result in the majority of the acidification because of the proton‐symport. This leads to the conclusion that cells of the proliferative type indeed show high growth rates together with high nutrition demand. Accordingly they have the prerequisite for fast NADH‐recycling via lactate. Oxidative phenotypes tend to appear with slow growth or no growth at all, at which oxygen consumption per metabolized substrate is maximized. This leads to the conclusion that the respiratory chain is highly utilized. The variable values of the optimization experiments described above are glutamine and FCS in different media. An increasing concentration of glutamine leads initially to an increase in growth rate. Further increase causes a drop due to the toxic byproduct ammonium. Glutamine is often discharged in form of lactate or used as a building block molecule. Thus a raise in concentration ends in higher cell densities or lower observed pHmin, which is consistent with literature. When specifically targeting metabolism, it was possible to provoke a certain response of one individual COSIR‐sensor. Hence, a higher acidification results from the application of cobalt on a cell culture, which mimics hypoxia to a large degree. Experiments with ionomycin showed increased metabolism via raised intracellular calcium concentrations as a possible explanation. Excessive increase in calcium levels conducts cell death, which was also demonstrated. Inhibition of individual complexes of the respiratory chain has an impact on monitored oxygen uptake rate (OUR). Cytometric methods indicate further initiation of apoptosis‐related signal cascades. With this knowledge, oligomycin can be utilized to study its impact and use it to induce certain metabolic pathways. Due to inhibited respiratory chain cells are now forced to use glycolysis for energy generation. This affects ATP‐levels of the cells in an early phase of drug application. The data obtained by an ad‐hoc method for analysis of hypoxia marker molecules suggests, that oligomycin inhibits the cell but does not mimic hypoxia, as i.e. hypoxanthine was still converted to uric acid. XIIA consequence of the planed hardware is a challenge for Live‐Cell‐Imaging. Solely transmitted light techniques with simple optics were applied. This means that only bright field images are available. So a further intention of this work is to offer ideas, which data can be generated from such a source. Evaluation of the cell’s morphology and distance to its neighbours (single cell‐, monolayer and agglomeration‐feature) parameters were extracted. These parameters can be allocated to data from media analysis or sensors like pH. The outcome was an interesting correlation between important changes in growth phases and course of the graph. Concluding, this work gives a summary of applications expressing the advantages of this sensorcombination. It motivates for further investigations in the field of process automation. Feature extraction from microscopy images showed to be an issue, so data processing and drug testing experiments should be intensified in future work. |
