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Ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Infektionen mit dem humanen Zytomegalievirus (HCMV) nach Stammzelltransplantation ist die adoptive Immuntherapie mit virusspezifischen T-Zellen. Allerdings ist diese Therapie bei HCMV-seropositiven Patienten, die ein Transplantat von einem HCMV-seronegativen Donor erhalten haben, aufgrund der geringen Frequenz HCMV-spezifischer T-Zellen im Blut des Spenders nicht anwendbar. Alternativ könnten polyklonale T-Zellen infundiert werden, in welche die Virus-Spezifität durch Expression von chimären Antigenrezeptoren (CAR) eingebracht wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro das Potential eines Ansatzes zur adoptiven Immuntherapie von HCMV-Infektionen untersucht, bei dem T-Zellen durch einen CAR gegen das Glykoprotein B des HCMV gerichtet werden. Die Funktionalität dieses CAR wurde bereits in Vorarbeiten demonstriert. Es stellte sich jedoch in dieser Arbeit heraus, dass CAR-modifizierte T-Zellen HCMV-infizierte Vorhautfibroblasten (HFF) nicht abtöten, obwohl antigenexprimierende nicht-infizierte Zielzellen effizient lysiert wurden. Eine Reduktion der Lyse von HFF ab dem 2. Tag nach der HCMV-Infektion wurde auch bei T-Zellrezeptor (TCR)-induzierter Aktivierung der T-Zellen beobachtet. Im Gegensatz zur CAR-vermittelten Erkennung konnte jedoch mit der TCR-vermittelten Erkennung eine deutliche Lyse von HCMV-infizierten HFF durch Verlängerung der Inkubationszeit erzielt werden. Eine reduzierte CAR- bzw- TCR-vermittelte Aktivierung der T-Zellen als Grund für die Lysehemmung konnte ausgeschlossen werden, da eine reduzierte Degranulation oder verringerte Zytokinfreisetzung nicht beobachtet wurde. Trotzdem konnte gezeigt werden, dass CAR-T-Zellen antiviral wirksam sein können, indem sie durch die sezernierten Zytokine TNF und IFN-γ die Ausbreitung der HCMV-Infektion effizient hemmen. Zur näheren Charakterisierung der beobachteten Lysehemmung wurde der Einfluss der anti-apoptotischen HCMV-kodierten Proteine UL36 und UL37x1 auf die T-Zellvermittelte Zytolyse untersucht. Tatsächlich konnte die Expression dieser viralen Proteine in HFF den durch CAR-exprimierende T-Zellen induzierten Zelltod teilweise reduzieren. Dabei konnte nicht nur die Todesrezeptor-vermittelte sondern auch die Perforin-vermittelte Apoptose durch die Expression beider Proteine gehemmt werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmals einen Immunevasionsmechanismus des HCMV, der auf einer Blockade der zytotoxischen T-Zellfunktionen beruht. Diese Blockade wird zum Teil durch die viralen Proteine UL36 und UL37x1 vermittelt und inhibiert die Lyse der infizierten Zellen durch CAR-modifizierte T-Zellen. Dennoch könnten CAR-modifizierte T-Zellen z.B. durch Sekretion von Zytokinen die Infektion eindämmen und so ein wirksames Therapeutikum darstellen. Restoring the virus-specific immunity by application of virus-specific T cells for adoptive therapy of human cytomegalovirus (HCMV) infections after stem cell transplantation is an attractive treatment option. However, this strategy is not applicable in the setting of a HCMV-seronegative patient and a HCMV-seropositive stem cell donor due to low frequencies of HCMV-specific T cells in the blood of seronegative donors. Alternatively, chimeric antigen receptors (CAR) can be used to introduce virus-specificity into a polyclonal T cell population. For this purpose, the potential of a CAR-based adoptive immunotherapy directed against the glycoprotein B of HCMV was investigated. The functionality of this HCMV-specific CAR in T cells has already been demonstrated. However, the present study revealed that CAR-induced lysis of HCMV-infected foreskin fibroblasts (HFF) is strongly reduced although lytic activity of CAR-modified T cells against antigen-expressing non-infected target cells was observed. Similarly, T cell receptor (TCR)-mediated lysis of HFF was inhibited by HCMV starting at day 2 after infection. In contrast to CAR-mediated recognition, TCR-mediated recognition of target cells allowed for inducing substantial cell death of HCMV-infected HFF by prolonging the incubation time. Notably, the observed reduction of the lysis of HCMV-infected cells was not associated with impairment of CAR-mediated or TCR-mediated activation of T cells, since effector functions like degranulation and cytokine release were not inhibited. Nevertheless, it was shown that CAR-expressing T cells could be potent mediators of antiviral activity by secretion of TNF und IFN-γ, which efficiently inhibit HCMV dissemination. Additionally, the underlying mechanism of the observed lysis inhibition was investigated by analyzing the impact of the HCMV-encoded anti-apoptotic proteins UL36 and UL37x1 on T cell-mediated lysis. Overexpression of these proteins could protect HFF from CAR-mediated lysis. Remarkably, expression of both proteins could not only inhibit death receptor-induced apoptosis but also perforin-mediated cell death. The thesis scrutinizes for the first time a mechanism of immune escape, which is based on efficient impairment of T cell cytotoxicity. This mechanism is partially mediated by the HCMV-encoded proteins UL36 and UL37x1 and abrogates the cytolytic activity of CAR-expressing T cells. Still, the administration of these CAR-T cells could be attractive since other effector functions like release of cytokines also contribute to the control of HCMV infection. |
