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Background Volumetric muscle loss exceeds the natural regeneration capacity of skeletal muscle tissue. The current clinical approach to treatment requires donor tissue transfer, including free autologous muscle flaps, and is often accompanied by extensive donor site morbidity. Tissue engineering of functional skeletal muscle is a promising alternative solution in cases of volumetric muscle loss. There have been numerous studies conducted on various cell types to investigate their myogenic differentiation potential, including adipogenic mesenchymal stromal cells (ADSC) and myoblasts (Mb). On biocompatible electrospun poly-ɛ-caprolacton (PCL)-collagen I-nanofibers, co-cultures of ADSC and Mb (Mb/ADSC) have been successfully differentiated. The goal of this study was to co-culture schwann cells (SC) with Mb/ADSC on PCL-collagen I-nanofibers in order to examine how neural cells influence myogenic differentiation, which is necessary for the generation of functional muscle-nerve constructs, both in two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) models. SC, as a component of the peripheral nervous system, was expected to promote myogenic differentiation in Mb/ADSC co-cultures. Material and Methods For cell culture, Mb and ADSC were isolated from human tissue. Characterization of the isolated primary myoblasts was performed by immunofluorescence. ADSC were characterized by flow cytometry and by their ability to differentiate into the adipogenic, osteogenic and chondrogenic lineage. Human SC were purchased from Innoprot and characterised by immunofluorescence staining. To determine the optimal concentration of Mb, ADSC, and SC co-culture, three groups were formed with different ratios of Mb/ADSC/SC (1:1:1; 1:1:0.5; 1:1:0.25). They were co-cultured 2D and myogenically differentiated for 3, 7, and 14 days. A creatine kinase (CK) assay was used to evaluate the optimal ratio of Mb/ADSC/SC. Mb/ADSC were then compared to Mb/ADSC/SC in terms of their ability to produce myotubes, as determined by immunofluorescent labeling for myosin heavy chain (MHC) after differentiation for 7,14, and 28 days. The immunofluorescent images were used to calculate the myotube fusion index and the myotube maturation index. Furthermore, 3D co-culture of PCL-collagen I-nanofibers was carried out. Viability of the cells on the scaffolds was determined using wst-8 and live dead assays. The live dead assay images were further used to calculate the necrotic index (NI) and apoptotic index (AI). Evaluation of myogenic differentiation was performed via immunofluorescence and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of gene expression of the myogenic markers Myosin Heavy Chain 2 (MYH2), skeletal muscle actin-α-1(ACTA1) and myogenin (MYOG). Results Mb showed more than 95% desmin expression. The isolated ADSCs were more than 95% positive for CD90, CD73, and CD105 and could be successfully differentiated osteogenically, adipogenically and chondrogenically. SC were positive for GFAP, P75 and S100. Mb/ADSC/SC at a ratio of 1:1:0.5 were chosen for further experiments based on the results of the CK assay. Regarding their myogenic differentiation capacity, Mb/ADSC/SC in a ratio of 1:1:0.5 were compared to Mb/ADSC in a ratio of 1:1 in terms of their myogenic differentiation capacity. Mb/ADSC/SC showed higher percentage of mature myotubes after 14 days of myogenic differentiation (p = 0.026) and of myotubes after 28 days of myogenic differentiation (p = 0.031) in 2D co-cultures. During 3D cell culture on PCL-collagen I-nanofiber scaffolds, cell viability did not differ between Mb/ADSC and Mb/ADSC/SC (p = 0.333 after 0 days, p = 0.100 after 14 days, and p = 0.068 after 28 days). The AI and NI did not differ between Mb/ADSC/SC and Mb/ADSC after 14 and 28 days of myogenic differentiation (after 14 days: p = 0.175 and p = 0.112, respectively; after 28 days: p = 0.071 and p = 0.157, respectively). Gene expression of ACTA1 was the same for Mb/ADSC and Mb/ADSC/SC after 28 days of myogenic differentiation (p=0.362) while expression of both MYH2 and MYOG was higher in Mb/ADSC/SC after 28 days (p = 0.003 and p = 0.033, respectively). In Mb/ADSC/SC, immunofluorescence labeling for MHC revealed well aligned multinucleated cells. Conclusion This study demonstrated that SC as a neuronal cell was capable of promoting myoblast and ADSC myogenic differentiation in co-culture. They also promoted myogenic differentiation of Mb and ADSC on PCL-collagen I-nanofibers. We established a physiological model for skeletal muscle tissue engineering by co-culturing primary Mb/ADSC/SC on biocompatible aligned PCL-collagen I-nanofibers. This may provide a critical foundation for future clinical usage. Hintergrund und Ziele Der volumetrische Muskelschwund übersteigt die natürliche Regenerationsfähigkeit des Skelettmuskelgewebes. Der derzeitige klinische Behandlungsansatz erfordert den Transfer von Spendergewebe, einschließlich freier autologer Muskellappen, und ist häufig mit einer erheblichen Morbidität an der Spenderstelle verbunden. Daher ist das Tissue Engineering zur Züchtung funktionellen Skelettmuskelgewebes ein vielversprechender Ersatz zur Behandlung von volumetrischem Muskelverlust. Es wurden zahlreiche Studien mit verschiedenen Zelltypen durchgeführt, um deren myogenes Differenzierungspotenzial zu untersuchen, einschließlich adipogener mesenchymaler Stammzellen (ADSC) und Myoblasten (Mb). Auf biokompatiblen elektrogesponnenen Polycaprolacton (PCL)-Collagen I-Nanofasern wurden Ko-Kulturen von ADSC und Mb (Mb/ADSC) erfolgreich differenziert. Diese Arbeit soll zur Generation von funktionellem Skelettmuskel beitragen. Ziel dieser Studie war es, Schwann-Zellen (SC) mit Mb/ADSC (auf PCL-Collagen I-Nanofasern) zu kultivieren, um den Einfluss von SC auf die myogene Differenzierung der Ko-Kulturen sowohl in einem zweidimensionalen (2D) als auch in einem dreidimensionalen (3D) Setting zu untersuchen. Es wurde erwartet, dass SC als Bestandteil des peripheren Nervensystems zur Förderung der myogenen Differenzierung in Mb/ADSC-Ko-Kulturen beitragen würde. Material und Methoden Für die Zellkultur wurden Mb aus menschlichem Muskelgewebe und ADSC aus menschlichem Fettgewebe isoliert. Die Charakterisierung der isolierten Primärzellen erfolgte durch Immunfluoreszenz bzw. Durchflusszytometrie. Die Eigenschaften der ADSC wurden auch durch adipogene, osteogene und chondrogene Differenzierung validiert. SC wurden kommerziell erworben und durch Immunfluoreszenzfärbung charakterisiert. Um die optimale Konzentration von Mb, ADSC und SC in der Co-Kultur zu bestimmen, wurden drei Gruppen mit unterschiedlichen Verhältnissen von Mb/ADSC/SC (1:1:1; 1:1:0,5; 1:1:0,25) gebildet und in 6-Well-Kulturplatten in einer Dichte von 300.000 Zellen 2D über 3, 7 und 14 Tage myogen differenziert. Die Auswertung erfolgte mittels Kreatinkinase-Assay. Mb/ADSC wurden dann mit Mb/ADSC/SC hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bildung von Myotuben verglichen, wie durch Immunfluoreszenzmarkierung für die schwere Myosinkette (MHC) nach der Differenzierung über 7, 14 und 28 Tage ermittelt wurde. Die Immunfluoreszenzbilder wurden zur Berechnung des Myotubenfusionsindexes (MFI) (Anzahl der Nuklei in mehrkernigen Myotuben in Relation zur Gesamtzahl der Nuklei) und des Myotubenreifungsindexes (MMI) (Anzahl der Myotuben mit 5 oder mehr Nuklei in Relation zur Gesamtzahl der mehrkernigen Myotuben) verwendet. Außerdem wurde eine dreidimensionale (3D) Co-Kultur auf PCL-Collagen I-Nanofasern durchgeführt. Die Vitalität der Zellen auf den Fasern wurde mit Hilfe von wst-8- und Live-Dead-Assays bestimmt. Die Bilder des Live-Dead-Assays wurden zur Berechnung des Nekrose-Index (NI) (Anzahl nekrotischer Zellen in Relation zur Gesamtzellzahl) und des Apoptose-Index (AI) (Anzahl apoptotischer Zellen in Relation zur Gesamtzellzahl) verwendet. Die Bewertung der myogenen Differenzierung erfolgte mittels Immunfluoreszenz und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) der Genexpression der myogenen Marker Myosin Heavy Chain 2 (MYH2), Skelettmuskel-α-Actinin (ACTA1) und Myogenin (MYOG). Ergebnisse Mb wiesen zu mehr als 95 % eine positive Desmin-Expression auf. Die isolierten ADSC waren zu mehr als 95 % positiv für typische Oberflächenmarker (CD90, CD73 und CD105) mesenchymaler Stammzellen und konnten erfolgreich osteogen, adipogen und chondrogen differenziert werden. Schwann-Zellen wiesen ebenfalls typische Oberflächenmarker (GFAP, P75 und S100) auf. Mb/ADSC/SC in einem Verhältnis von 1:1:0,5 zeigten die günstigsten Ergebnisse hinsichtlich der CK-Aktivität. Mb/ADSC/SC in einem Verhältnis von 1:1:0,5 wurden sodann mit Mb/ADSC (in einem Verhältnis von 1:1) hinsichtlich ihrer myogenen Differenzierungskapazität verglichen. Bei den 2D Ko-Kulturen zeigten die Mb/ADSC/SC im Vergleich zu den Mb/ADSC einen höheren Anteil reifer Myotuben nach 14 Tagen myogener Differenzierung (p = 0,026) sowie mehr Myotuben nach 28 Tagen myogener Differenzierung (p = 0,031). Während der 3D-Zellkultur auf PCL-Collagen I-Nanofaser-Scaffolds unterschied sich die Zellviabilität nicht zwischen Mb/ADSC und Mb/ADSC/SC (p = 0,333 nach 0 Tagen, p = 0,100 nach 14 Tagen und p = 0,068 nach 28 Tagen). Der AI und der NI von Mb/ADSC/SC unterschieden sich nicht signifikant von Mb/ADSC nach 14 und 28 Tagen myogener Differenzierung (nach 14 Tagen: p = 0,175 bzw. p = 0,112; nach 28 Tagen: p = 0,071 bzw. p = 0,157). Im Vergleich zu den Mb/ADSC gab es für die ACTA1-Expression bei den Mb/ADSC keinen statistisch signifikanten Unterschied (p = 0,362). Die Genexpression von MYH2 und MYOG war bei den Mb/ADSC/SC nach 28 Tagen höher (p = 0,003 bzw. p = 0,033). In Mb/ADSC/SC zeigte die Immunfluoreszenzmarkierung für MHC gut ausgerichtete vielkernige Zellen. Schlussfolgerung In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Ko-Kulturen von Mb und ADSC auf PCL-Kollagen I-Nanofasergerüsten durch Schwann-Zellen zur myogenen Differenzierung angeregt werden können. Wir haben ein physiologisches Modell für das Tissue Engineering von Skelettmuskeln geschaffen, indem wir primäre Mb/ADSC/SC auf biokompatiblen, ausgerichteten PCL-Kollagen I-Nanofasern 3D kultiviert haben. Dies könnte eine wichtige Grundlage für die künftige klinische Anwendung sein. |
