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Background and aims: Cancer is a widespread disease characterized by uncontrollable cell proliferation and spread of metastasis. Lung cancer is the second most commonly diagnosed cancer and non-small cell lung cancer (NSCLC) represents the prevalent histological subtype. Despite the recent advances in the early diagnosis and in the therapeutic approaches, lung cancer remains the leading cause of cancer-related death worldwide for both men and women. As consequence, it is of paramount importance the identification of novel targets to improve the management of NSCLC. It is known that cancer cells alter their metabolism during tumorigenesis and cancer progression in order to sustain the elevated energetic demand. Targeting key metabolic vulnerabilities becomes, therefore, an attractive therapeutic approach with high potential. Since cancer cells rely on functional heat shock proteins (HSPs) to guarantee the correct folding of oncoproteins and metabolic enzymes, in recent years pivotal studies have pointed to develop anti-HSPs drugs as new anti-cancer strategies. This study focused first on the evaluation of the effects of a new synthetic small molecule, called KHS101 on several NSCLC cell lines. Since KHS101 has been demonstrated to disrupt the function of the mitochondrial heat shock protein family D member 1 (HSPD1 or HSP60), we secondly investigated HSPD1 function in NSCLC and evaluated the biology of HSPD1 targeting in order to identify determinants of sensitivity. Methods: Growth of knockdown and drug-treated NSCLC cells was monitored in vitro through real-time proliferation assays, cell viability and cytotoxicity assays, colony formation assays and cell cycle analysis. Real-time metabolic assays were used to evaluate cell metabolic activity. Subcutaneous injections and tail vein metastasis assays were used to monitor in vivo growth of knockdowns or KHS101 treatment. Factors determining KHS101 sensitivity were identified through a drug profiling combined with transcriptomic analysis and a whole-genome CRISPR/Cas9 screen. Immunohistochemistry from formalin-fixed paraffin-embedded tissues from NSCLC patients was used to determine HSPD1 expression. Results and observations: We could show that both shRNA-mediated gene silencing of HSPD1 and chemical interference by KHS101 markedly impaired the metabolic capacities of NSCLC cells and suppressed cell proliferation in vitro. Moreover, HSPD1 knockdown reduced tumor growth in vivo and KHS101 appeared to prolong disease-specific survival time of tumor-bearing mice and to enhance cisplatin cytotoxicity in vitro. Finally, we demonstrated that the anti-cancer effects of HSPD1 targeting are related to the metabolic state of the cells, in particular, they are dependent on the oxidative phosphorylation. The creatine-transporter SLC6A8 and the subunit 5B of the cytochrome c oxidase (COX5B) resulted to be molecular determinants of the HSPD1-targeting molecule sensitivity. Conclusions and discussion: All together these results underline the importance of mitochondrial metabolism as a potential target for anti-cancer therapy and suggest HSPD1 as an attractive target for developing new therapeutic strategies for NSCLC. Hintergrund und Ziele: Krebs ist eine weit verbreitete Krankheit, die durch unkontrollierte Zellproliferation und Metastasenbildung gekennzeichnet ist. Lungenkrebs ist die am zweithäufigsten diagnostizierte Krebsart, wobei der nicht-kleinzellige Lungenkrebs (NSCLC) den häufigsten histologischen Subtyp darstellt. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Frühdiagnose und bei den therapeutischen Ansätzen ist Lungenkrebs nach wie vor die weltweit häufigste krebsbedingte Todesursache bei Männern und Frauen. Daher ist die Identifizierung neuer Zielmoleküle zur Verbesserung der Behandlung von NSCLC von größter Bedeutung. Es ist bekannt, dass Krebszellen ihren Stoffwechsel während der Tumorentstehung und des Fortschreitens des Krebses verändern, um den erhöhten Energiebedarf zu decken. Die Behebung von Schwachstellen im Stoffwechsel ist daher ein attraktiver therapeutischer Ansatz mit großem Potenzial. Da Krebszellen auf funktionierende Hitzeschockproteine (HSPs) angewiesen sind, um die korrekte Faltung von Onkoproteinen und Stoffwechselenzymen zu gewährleisten, haben in den letzten Jahren entscheidende Studien darauf hingedeutet, Anti-HSPs-Medikamente als neue Strategien zur Krebsbekämpfung zu entwickeln. Diese Studie konzentrierte sich zunächst auf die Bewertung der Auswirkungen eines neuen synthetischen kleinen Moleküls namens KHS101 auf verschiedene NSCLC-Zelllinien. Da KHS101 nachweislich die Funktion des mitochondrialen Hitzeschockproteins der Familie D, Mitglied 1 (HSPD1 oder HSP60), stört, untersuchten wir zweitens die Funktion von HSPD1 bei NSCLC und bewerteten die Biologie des HSPD1-Targetings, um Determinanten der Empfindlichkeit zu identifizieren. Methoden: Das Wachstum von Knockdown- und medikamentenbehandelten NSCLC-Zellen wurde in vitro mit Hilfe von Echtzeit-Proliferationsassays, Zelllebensfähigkeits- und Zytotoxizitätstests, Koloniebildungstests und Zellzyklusanalysen überwacht. Zur Bewertung der Stoffwechselaktivität der Zellen wurden Echtzeit-Stoffwechselassays verwendet. Subkutane Injektionen und Metastasierungstests in der Schwanzvene wurden zur Überwachung des In-vivo-Wachstums von Knockdowns oder KHS101-Behandlung verwendet. Faktoren, die für die Empfindlichkeit von KHS101 ausschlaggebend sind, wurden durch ein Arzneimittelprofil in Kombination mit einer transkriptomischen Analyse und einem CRISPR/Cas9-Screening des gesamten Genoms ermittelt. Immunhistochemische Untersuchungen an formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Geweben von NSCLC-Patienten wurden zur Bestimmung der HSPD1-Expression verwendet. Ergebnisse und Beobachtungen: Wir konnten zeigen, dass sowohl die shRNA-vermittelte Ausschaltung des Gens HSPD1 als auch die chemische Interferenz durch KHS101 die Stoffwechselkapazitäten von NSCLC-Zellen deutlich beeinträchtigten und die Zellproliferation in vitro unterdrückten. Darüber hinaus verringerte die Ausschaltung von HSPD1 das Tumorwachstum in vivo, und KHS101 schien die krankheitsspezifische Überlebenszeit von Mäusen, die einen Tumor trugen, zu verlängern und die Zytotoxizität von Cisplatin in vitro zu erhöhen. Schließlich konnten wir zeigen, dass die krebshemmenden Wirkungen des HSPD1-Targetings mit dem Stoffwechselzustand der Zellen zusammenhängen, insbesondere sind sie von der oxidativen Phosphorylierung abhängig. Der Kreatin-Transporter SLC6A8 und die Untereinheit 5B der Cytochrom-c-Oxidase (COX5B) erwiesen sich als molekulare Determinanten für die Empfindlichkeit der HSPD1-Zielmoleküle. Schlussfolgerungen und Diskussion: Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung des mitochondrialen Stoffwechsels als potenzielles Ziel für die Krebstherapie und deuten darauf hin, dass HSPD1 ein attraktives Ziel für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für NSCLC ist. |
