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Dissertação de mestrado em Microbiologia Aplicada, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2019 O trabalho apresentado nesta Dissertação de Mestrado foi realizado no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge sob a orientação direta da Doutora Elisabete Valério. As cianobactérias são microrganismos procariotas que se encontram maioritariamente em comunidades fitoplantónicas. Sob condições favoráveis, estas são capazes de atingir grandes densidades celulares (blooms). Algumas espécies de cianobactérias produzem cianotoxinas que podem ser prejudiciais para a saúde pública e animal. Das cianotoxinas conhecidas, foram escolhidas a Microcistina-LR (MC-LR) e a Cilindrospermopsina (CYL) para desenvolver este trabalho. Tendo em conta a frequente ocorrência e a elevada toxicidade da MC-LR, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estabeleceu um valor limite de concentração desta toxina na água potável de 1 μg/L. Para a CYL ainda não há um valor guia, pelo que não está controlada. Os ensaios de viabilidade celular são muito usados para procurar moléculas com efeitos na proliferação celular ou efeitos tóxicos que possam levar à morte celular. Para realizar estes ensaios, foi selecionada a levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), já anteriormente usada para investigar mecanismos moleculares de toxicidade da Microcistina-LR (MC-LR). Neste estudo foi usado o ensaio de Brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), após exposição das leveduras a diferentes concentrações das cianotoxinas. Neste ensaio, células viáveis com metabolismo ativo convertem o reagente MTT num produto de cor roxa, que nos permite quantificar a viabilidade das células testadas, enquanto que células mortas não conseguem fazer essa conversão. Testou-se ainda uma enzima lítica, a Liticase, a qual vai atuar e digerir a camada externa da parede celular. Para além do ensaio MTT, foi também testado o ensaio de coloração com Azul Tripano (AT), que é usado para determinar o número de células viáveis (que excluem o corante) presentes numa suspensão, onde é feita a contagem das células por observação direta ao microscópio em Câmara de Neubauer. Este trabalho permitiu dar uma contribuição numa área ainda pouco explorada, referente ao uso de métodos de análise de viabilidade celular para detetar efeitos citotóxicos provocados por duas cianotoxinas, utilizando S. cerevisiae como organismo eucariota modelo. Como conclusões, dos dois métodos usados neste estudo, o ensaio MTT é o mais fiável na medida em que o comportamento dos controlos reflete claramente o que está descrito na literatura para os mesmos (p ≤ 0,05). Contudo, o método AT revelou ser bastante reprodutível. No que diz respeito às toxinas, não se observam efeitos citotóxicos significativos em S. cerevisiae (p > 0,05) com nenhuma das duas toxinas testadas. Quando foi usada liticase de forma a facilitar a entrada das toxinas nas células, estes ensaios também não refletiram efeitos citotóxicos significativos (p > 0,05). Cyanobacteria are prokaryotic microorganisms found mostly in phytoplanktonic communities. Under favorable conditions, they are capable to reach high cell densities (blooms). Some cyanobacterial species produce cyanotoxins that can be harmful to public and animal health. Among the known cyanotoxins, Microcystin-LR (MC-LR) and Cylindrospermopsin (CYL) were chosen to develop this work. Given the frequent occurrence and high toxicity of MC-LR, World Health Organization (WHO) has established a guideline value for this toxin in drinking water of 1 μg / L. There is still no guideline value for CYL yet, so this toxin is not controlled. Cell viability assays are widely used to look for molecules with effects on cell proliferation or toxic effects that may lead to cell death. To perform these assays, the yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), already previously used to investigate molecular mechanisms of Microcystin-LR (MC-LR) toxicity, was selected to perform this study. In this study the 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium (MTT) bromide assay was used after exposure of yeast cells to different concentrations of these two cyanotoxins. In this assay, viable cells with active metabolism convert MTT reagent into a purple product, which allows us to quantify the viability of the cells tested, while dead cells cannot make this conversion. We also tested a lytic enzyme, Liticase, which will act on the outer layer of the cell wall, degrading it. In addition to the MTT assay, the Trypan Blue staining assay, which is used to determine the number of viable cells (able to exclude the dye) that are present in a suspension, was also tested. The cells are counted by direct observation under the microscope in a Neubauer Chamber. This work intended to give a contribution to an area still under-explored, related with the use of cell viability tests to evaluated cytotoxic effect of two cyanotoxins, and the yeast S. cerevisiae as eukaryotic model organism. As conclusions, from the two methods used in this study, the MTT assay is the most reliable and reproducible as the behavior of the controls clearly reflects what is described in the literature for them (p ≤ 0.05). For toxins, no significant cytotoxic effects are observed in S. cerevisiae (p > 0.05). Liticase was tested to facilitate the toxins entrance into the cells, however, these trials also did not reflect significant effects (p > 0.05). N/A |
