| Popis: |
Дисертація присвячена встановленню нових механізмів розвитку дисфункції ендотелію (ДЕ) за есенційної артеріальної гіпертензії (ЕАГ) з урахуванням гуморально-метаболічних, гендерних та молекулярно-генетичних чинників (поліморфізму генів ендотеліальної оксиду азоту синтази NOS3 (786T>C, rs2070744) та гуанін нуклеотид-зв'язуючого протеїну beta-3 GNB3 (825С>Т, rs5443)). Вперше розроблено та патогенетично обґрунтовано нові способи прогнозування і ранньої діагностики ДЕ за ЕАГ, стратифіковано групи ризику. Хворих на ЕАГ для дослідження відбирали відповідно до рекомендацій національних (наказу МОЗ України №384 від 24.05.2012 року, Української асоціації кардіологів, 2017 року) та Європейських товариств кардіології і гіпертензії (ESC, ESH, 2018) [11, 13, 297]. Скринінговий відбір на відповідність критеріям включення / виключення пройшли 100 хворих на ЕАГ із ураженням органів-мішеней (гіпертофією лівого шлуночка (ГЛШ) – ЕАГ ІІ стадії), від помірного до дуже високого серцево-судинного ризику (ССР). Контрольну групу склали 48 практично здорових осіб без серцево-судинної патології. Середній вік хворих становив 57,85±8,02 років, у групі контролю – 49,13±6,28 років. Гендерний розподіл між групами спостереження суттєво не відрізнявся: серед хворих чоловіків (Ч) було 25,0%, жінок (Ж) – 75,0%, у контрольній групі – 37,5% і 62,5%, відповідно (р>0,05). Особи дослідної та контрольної груп не перебували у родинних стосунках. Робота виконана з дотриманням основних вимог GCP і GLP, а також біомедичної етики щодо проведення наукових медичних досліджень за участі людини. Дослідження носило проспективний, одномоментний характер, було когортним, за зразком "контроль-випадок". Всі обстежені підписали інформовану згоду на участь у ньому. У 68% хворих на ЕАГ встановили обтяжений сімейний анамнез за серцево-судинною патологією, що було у 2,5 рази частіше, ніж у контролі – 27,08% (р0,05). 32% хворих мали компенсований ЦД 2 типу. Поділ пацієнтів на групи спостереження проводили за тяжкістю ДЕ, ЕАГ (за ступенем елевації артеріального тиску (АТ)), показником індексу маси тіла (ІМТ), поліморфними варіантами генів NOS3 (rs2070744) та GNB3 (rs5443), товщиною "інтима-медіа" загальної сонної артерії (ТІМ ЗСА: 0,85 уо, Ч >0,95 уо), розміром ОТ (норма, чи понад норма – Ч >102 см, Ж >88 см) та з урахуванням статі. Для реалізації поставленої мети в роботі застосовано наступні методи дослідження: загальноклінічні (збір скарг, анамнезу життя та хвороби, огляд, загальний аналіз крові та сечі, офісне вимірювання АТ, ЧСС); антропометричний (маса тіла, зріст, ІМТ, ОТ, ОС); біохімічний (глюкоза, креатинін, білірубін та його фракції, ферменти печінки, сечовина, сечова кислота); колориметричний (загальний холестерол (ЗХС), тригліцериди (ТГ), холестерол ліпопротеїнів високої та низької щільностей (ХС ЛПВЩ, ХС ЛПНЩ) із наступним розрахунком індексу атерогенності (ІА); сумарні метаболіти монооксиду нітрогену NO – NO/нітрити/нітрати); імуноферментний (розчинна внутрішньосудинна молекула адгезії – sVCAM-1); інструментальні дослідження (ЕКГ у 12-ти відведеннях, ЕхоКГ, допплерографія сонних артерій для визначення ТІМ ЗСА і внутрішньої сонної артерії (ВСА), проба на реактивну гіперемію – ендотелій-залежну вазодилатацію плечової артерії (ЕЗВДПА); генетичні (якісна полімеразна ланцюгова реакція в режимі реального часу (qRT-PCR) для визначення поліморфізму генів NOS3 (rs2070744), GNB3 (rs5443) та встановлення транскрипційної активності гена NOS3 за рівнем мРНК методом qRT-PCR зі зворотною транскрипцією; статистично-аналітичні методи. За потреби хворі пройшли офтальмологічне та неврологічне обстеження, консультацію кардіолога. Електронну базу даних створили в програмі Excel® 2010 (Microsoft). Статистичні підрахунки виконали за допомогою прикладних програм MS® Excel® 2010™ та Statistica® 7.0 (StatSoft Inc., США). Отримані нами результати засвідчують, що розвиток і прогресування ДЕ у хворих на ЕАГ асоціюють із поліморфізмом генів NOS3 (rs2070744) і GNB3 (rs5443), які реалізують свою транскрипційну активність через експресію білкових структур / ферментів залучених у механізмах діяльності окремих ланок ренін-ангіотензин-альдостеронової системи (РААС), каталізують широкий спектр метаболічних реакцій, опосередковано впливають на вазоактивні та нейрогуморальні процеси, а також визначають активність відповідних епігеномних структур. Вперше виявили, що у популяції мешканців Північної Буковини хворих на ЕАГ мутація генів NOS3 (rs2070744) та GNB3 (rs5443) у гомозиготному стані зустрічається із частотою 16,67% і 8,33%, що вірогідно не відрізняється від практично здорових. Алельний розподіл відповідає такому для європеоїдів і не відхиляється від закону популяційної рівноваги HardyWeinberg. Генотипи та алелі аналізованих генів не є додатковими чинниками ризику появи ЕАГ та тяжкості її перебігу. Натомість, наявність у генотипі С-алеля гена NOS3, чи Т-алеля гена GNB3 підвищує ймовірність ожиріння у обстежених майже у 6 і 10 разів [OR=5,60; OR=10,12; рC поліморфізму гена NOS3 зі збільшенням САТ (F=4,43; р=0,015) і ДАТ (F=3,14; р=0,048), зменшенням вмісту сумарних метаболітів NO (F=71,11; р1050 нг/мл) майже у 12 і 4 рази [OR=11,77 і OR=3,73; р≤0,023], відповідно; у хворих із С-алелем гена NOS3 зростає ймовірність низької експресії гена NOS3 (за рівнем мРНК T) підвищує погранично ризик гіперліпідемії за рахунок атерогенного ХС ЛПНЩ (>3,0 ммоль/л) у 8,5 разів (p=0,05), за протективної ролі СС-генотипу [OR=0,12; p=0,048]. Вперше підтверджено зв'язок показників ДЕ, ТІМ із клінічно-лабораторними змінними залежно від поліморфних варіантів аналізованих генів: ЕЗВДПА зворотно корелює з рівнем ТГ (r=-0,45; р=0,042), ТІМ ЗСА (r=- 0,88-/-0,44/; р≤0,006-0,001) і D ЗСА (r=-0,73; р1050-1390 нг/мл; виражена ДЕ (3-й ступінь) – за зменшення показників в межах нижнього квартиля (ЕЗВДПА 1390 нг/мл. У прогнозуванні тяжчого перебігу ДЕ до груп високого ризику слід відносити носіїв мутаційних С-алеля гена NOS3 (rs2070744) і Т-алеля гена GNB3 (rs5443): зростає ризик появи атеросклеротичних бляшок на ЗСА у 3,5-10 разів, зменшується ймовірність нормального рівня сумарних метаболітів NO2 - /NO3 - крові майже у 12 разів, зростає рівень sVCAM-1 у 4 рази. У власників С-алеля гена NOS3 додатково зростає ризик низької транскрипційної активності гена NOS3 у 69 разів (рC, rs2070744) and guanine nucleotide binding protein beta-3 GNB3 (825C>T, rs5443)). For the first time, new methods of prognosis and early diagnosis of ED for EAH were developed and pathogenetically substantiated; risk groups were stratified. EAH patients were selected for the study in accordance with national recommendations (Order of the Ministry of Health of Ukraine No. 384 from 24.05.2012, Ukrainian Association of Cardiology, 2017) and European Societies of Cardiology and Hypertension (ESC, ESH, 2018) [11, 13, 297]. 100 EAH patients with hypertensive-mediated target-organs damage (left ventricular hypertrophy (LVH) – EAH stage II), from moderate to very high cardiovascular risk (CVR), were screened with the inclusion/exclusion criteria compliance. The control group consisted of 48 practically healthy subjects without cardiovascular pathology. The average age of the patients was 57.85±8.02 yo, in the control group – 49.13±6.28 yo. The gender distribution between the groups did not differ significantly: among the patients there were 25.0% male (M), 75.0% female (F), in the control group – 37.5% and 62.5%, respectively (p>0.05). The control and study groups' subjects had no family relationship. The Study was performed in compliance with the basic requirements of GCP and GLP, as well as biomedical ethics regarding conducting scientific medical research with human participation. The study was prospective, single-moment, cohortbased and case-control. All subjects signed an informed consent to participate in it. In 68% of EAH patients a heavy family history of cardiovascular pathology was established, which was 2.5 times more frequent than in controls – 27.08% (p0.05). 32% of patients had compensated diabetes mellitus type 2 (DM2). Patients were divided into groups according to the severity of ED, EAH (according to the degree's elevation of blood pressure (BP)), body mass index (BMI), polymorphic variants of the genes NOS3 (rs2070744) and GNB3 (rs5443), the "intima-media" thickness of the common carotid artery (IMT CCA: 0.85, M >0.95), waist circumference (WC for M >102 cm, F >88 cm) and depending on gender. To realize the study aim, the following research methods were applied: general clinical (collection of complaints, anamnesis of life and illness, physical examination, complete blood count and urine analysis, office measurement of blood pressure (BP), heart rate); anthropometric (body weight, height, BMI, WC, WHR); biochemical (glucose, creatinine, bilirubin and its fractions, liver enzymes, urea, uric acid); colorimetric (total cholesterol (TC), triglycerides (TG), high- and low-density lipoprotein cholesterol (HDL-C, LDL-C) followed by calculation of the atherogenic index (AI); total metabolites of nitrogen monoxide NO – NO/nitrites/nitrates); Enzyme-linked Immunosorbent Assays (soluble Vascular Cell Adhesion Molecula-1 – sVCAM-1); instrumental methods (12-lead ECG, echocardiography, Doppler ultrasound examination to determine the IMT of the CCA and the internal carotid artery (ICA), test for reactive hyperaemia – Endothelium-Dependent Flow-Mediated Dilation of the Brachial Artery (FMD BA) Ultrasound Assessment; genetic (qualitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) to determine the polymorphism of NOS3 (rs2070744), GNB3 (rs5443) genes and the NOS3 gene transcriptional activity evaluation after the mRNA level by qRT-PCR-based method with reverse transcription; statistical analysis. Patients underwent a selective ophthalmological and neurological examination and cardiologist consultation if necessary. The electronic database register was created in Excel® 2010 (Microsoft). Statistical calculations were performed using MS® Excel® 2010™ and Statistica® 7.0 applications (StatSoft Inc., USA). Our results indicate that the ED development and progression in EAH patients is associated with the genes polymorphism NOS3 (rs2070744) and GNB3 (rs5443), which realize their transcriptional activity through the expression of protein / enzymes involved in the mechanisms of the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) separate links activities, catalyze a wide range of metabolic reactions, indirectly affect vasoactive and neuro-humoral processes and also determine the activity of the corresponding epigenetic structures. For the first time it was discovered that in the EAH patients' residents of Northern Bukovina the mutation of the genes NOS3 (rs2070744) and GNB3 (rs5443) in the homozygous state occurs with a frequency of 16.67% and 8.33%, which does not differ from that in the control group. The allelic distribution corresponds to that in Caucasians and does not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium. Genotypes and alleles of the analyzed genes are not additional risk factors for the EAH appearance and its course severity. Instead, the presence of the C-allele of the NOS3 gene or the T-allele of the GNB3 gene in the genotype increases the probability of obesity in the examined subjects almost 6 and 10 times [OR=5.60; OR=10.12; pC polymorphism of the NOS3 gene with an increase of SBP (F=4.43; p=0.015) and DBP (F=3.14; p=0.048), a decrease of total NO metabolites content (F=71.11; p1050 ng/ml) almost 12 and 4 times [OR=11.77 and OR =3.73; p≤0.023], respectively; in patients with the C-allele of the NOS3 gene, the probability of low expression of the NOS3 gene (by mRNA level T) in the patients' genotype marginally increases the hyperlipidemia risk due to atherogenic LDL-C elevation (>3.0 mmol/l) by 8.5 times (p=0.05), with a protective role of CC-genotype [OR=0.12; p=0.048]. For the first time the relationship of ED, IMT with clinical and laboratory variables was confirmed depending on the polymorphic variants of the analyzed genes: FMD BA is inversely correlated with the TG level (r=-0.45; р=0.042), IMT CCA (r=-0.88- /-0.44/; p≤0.006-0.001) and D CCA (r=-0.73; p1050-1390 ng/ml; advanced ED (3rd degree) - when the data decrease occurred within the lower quartile (FMD BA 1390 ng/ml. The mutated C-allele carriers of the NOS3 gene (rs2070744) and the Tallele of the GNB3 gene (rs5443) should be classified as high-risk groups in the prediction of a severe ED course: the risk of the atherosclerotic plaques appearance on CCA increases 3.5-10 times, the probability of a normal total NO2 - /NO3 - metabolites blood level decreases almost 12 times, the sVCAM-1 level increases 4 times. The C-allele of the NOS3 gene presence in genotype additionally increase the low transcriptional activity of the NOS3 gene risk 69 times (p |
