| Přispěvatelé: |
University of Helsinki, Faculty of Medicine, Institute of Clinical Medicine, Tutkimusohjelmayksikkö, Program of Molecular Neurology, Biomedicum Stem Cell Center, Helsingin yliopisto, lääketieteellinen tiedekunta, kliininen laitos, Helsingfors universitet, medicinska fakulteten, institutionen för klinisk medicin, Koistinaho, Jari, Otonkoski, Timo, Tuuri, Timo |
| Popis: |
Human pluripotent stem cells (including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells) are defined by two important characteristics: unlimited self-renewal capacity and ability to switch on various differentiation pathways. These unique properties make them valuable tools for basic research and for the development of regenerative therapies. Since the discovery of stem cells, diverse culture conditions have been developed. Pluripotent stem cells are cultured either in the presence of feeder cells or with extracellular matrix components that together with growing colonies create a niche supporting the growth of undifferentiated cells. Current standard in vitro cell culture techniques are based on the use of xenogeneic reagents. However, this is not compatible with the clinical applications of human pluripotent stem cells. The aim of this study was to develop optimal culture conditions for pluripotent stem cells without the use of xenogeneic reagents, based on the analysis of their cell surface glycan expression. Initially, postnatal human feeder cells, foreskin fibroblasts, were shown to support the derivation of new embryonic stem cell lines and continued undifferentiated growth of these cells. However, the growth rate of stem cells was significantly lower on human feeder cells than on mouse embryonic fibroblasts. This feature restricts the use of human feeder cells for large-scale cell production of stem cells. Next, a number of human embryonic stem cell lines were derived and characterized in detail. The results show that despite of similar basic characteristics in the undifferentiated state, the differentiation capacity of stem cell lines varies. This highlights the need to identify markers that reliably predict cell lineage propensity of the stem cells lines. To identify such predictive markers we conducted a global analysis of cell surface glycans expressed on pluripotent human stem cells. The results show that embryonic stem cells have a unique glycan fingerprint that differs from their differentiated derivatives. This suggests that information of stem cell surface glycans can be used to design markers that define specific stages of differentiation. In addition, this information can be used to develop defined reagents for stem cell culture. Based on the analysis of stem cell surface glycans, specific glycan-binding lectins were studied for their capacity to support human pluripotent stem cells. This lead to the discovery of a lectin, Erythrina Cristagalli (ECA) as a potent simple defined matrix for human pluripotent stem cells. This simple defined matrix, combined with a defined culture medium and the use of a Rho-kinase inhibitor at the time of cell propagation, allowed more efficient production of high-quality human pluripotent stem cells than Matrigel®, the current standard acellular matrix used for stem cell culture. Taken together, these studies advance the development of technologies needed for the efficient generation of fully undifferentiated human pluripotent stem cells in defined conditions. Pluripotenteilla kantasoluilla on kaksi erityispiirrettä: lähes rajaton jakautumiskyky ja kyky erilaistua moniksi erilaistuneiksi solutyypeiksi. Näiden ominaisuuksien ansiosta kantasoluilla on useita mahdollisia lääketieteellisiä ja farmakologisia sovelluskohteita. Tässä työssä on tutkittu ihmisen pluripotenttien kantasoluviljelmien erityisominaisuuksia ja viljelmien välisiä eroavaisuuksia niiden kyvyssä kasvaa ja erilaistua. Lisäksi on tutkittu kantasolujen solupinnan sokerirakenteita ja kehitetty sokerirakenteisiin perustuvia viljelymenetelmiä. Ensimmäisen osajulkaisun tavoitteena oli kehittää ihmisperäisten pluripotenttien solujen viljelyolosuhteita, joissa vältetään toisesta lajista (hiirestä) peräisin olevia komponentteja. Työssä osoitettiin ihmisperäisten fibroblastisolujen kykenevän toimimaan ihmisen alkion kantasolujen tukisoluina. Toisessa osatyössä kuvattiin viiden alkion kantasolulinjan tuotto ja karakterisaatio. Työssä tutkittiin myös viljelyolosuhteiden vaikutusta solujen kasvuun, kantasolulinjojen ilmentämiä geenituotteita ja erilaistumiskykyä. Tutkimuksessa havaittiin alkion kantasolujen muistuttavan geeni-ilmenemiseltään sukusolujen kantasoluja. Lisäksi osoitettiin kantasolulinjojen poikkeavan toisistaan erilaistumiskyvyltään huolimatta niiden samankaltaisesta geeni-ilmenemisestä. Kolmannessa osatyössä tutkittiin kantasolujen ilmentämiä N-glykaani sokerirakenteita. Työssä havaittiin massaspektrometrian avulla pluripotenteilla kantasoluilla oleva joukko niille tyypillisiä sokerirakenteita, jotka muuttuvat kantasolujen erilaistuessa. Neljännessä osatyössä kehitettiin kantasolujen viljelymenetelmiä hyödyntäen kolmannessa osatyössä havaittuja kantasolujen solupinnan sokerirakenteita ja osoitetaan erään lektiinin (Erythrina cristagalli) tukevan kantasolujen kiinnittymistä, kasvua ja kantasoluominaisuuksien säilymistä. Tämä työ osoittaa, että viljelyolosuhteiden kehittäminen ja validoiminen on ensiarvoisen tärkeää pluripotenttien kantasolulinjojen tutkimukselle ja lääke-tieteelliselle käytölle. |
