| Přispěvatelé: |
University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Doctoral Programme in Integrative Life Science, Division of Pharmacology and Pharmacotherapy, Faculty of Pharmacy, University of Helsinki, Helsingin yliopisto, bio- ja ympäristötieteellinen tiedekunta, Integroivien biotieteiden tohtoriohjelma, Helsingfors universitet, bio- och miljövetenskapliga fakulteten, Doktorandprogrammet i integrerande biovetenskap, Mervaala, Eero, Kaynak, Bogac |
| Popis: |
Disruption of chamber-specific gene regulatory networks underlies malformation of the heart and results in congenital heart disease. Re-activation of fetal gene regulatory networks in adults occurs during cardiac injury, and transcription factors composing these networks represent candidate therapeutic targets to impede heart failure progression. The identification of molecular markers and underlying regulators of cardiac chamber specification is thus an important step in understanding the aetiology of cardiovascular disease. Moreover, the examination of chemical modulation of molecular processes occurring during development allows for a more detailed understanding of the teratogenic effects of chemical compounds and could lead to the development of small molecule-based strategies for stimulating or impeding well-characterized developmental processes in the adult heart. To this end, this thesis is comprised of three studies related to the differentiation of atrial and ventricular cardiomyocytes and the selective modulation of this process. Study I led to the generation of an in vitro model of cardiomyocyte subtype specification of pluripotent stem cells for the use in studies II-III. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis of native embryonic atrial and ventricular tissue confirmed the robust ventricular-specific expression of myosin light chain 2 (Myl2) and also indicated the lack of an endogenous atrial-specific marker during early embryogenesis. Genome editing was used to integrate a fluorescent reporter into the endogenous Myl2 locus to mark cells of the ventricular lineage, whereas atrial cells were traced by an atrial-specific transgene driven by the slow myosin heavy chain 3 (SMyHC3) promoter. Atrial and ventricular reporter expression were confirmed in vivo by laser-assisted morula injection of reporter mouse embryonic stem cells (mESCs) and microscopy of chimeric embryos. In addition to this in vivo validation, spontaneous differentiation of reporter mESCs was characterized by qRT-PCR, indicating dynamic expression of retinoic acid signalling components. Differentiation assays were developed based on chemical perturbation of undifferentiated progenitor cells and differentiated cardiomyocytes, respectively. Members of the retinoid family, known teratogens and modulators of anterior-posterior patterning, were tested for effects on the activation of atrial and ventricular reporter genes. Additionally, a directed-differentiation assay was developed based on highly pure multipotent progenitor cells and differentiation assessment in a 384-well format. In this assay, chemical inhibitors of Wnt and Transforming growth factor β (Tgfβ) pathways led to promotion of ventricular reporter expression when added at the multipotent progenitor stage, but not after the onset of spontaneous beating. Additionally, exogenous all-trans retinoic acid added to undifferentiated progenitors led to an inhibition of ventricular differentiation, whereas addition following the onset of spontaneous beating led to activation of the ventricular reporter gene. In addition to chemical probes described in study I, novel compounds targeting the protein-protein interaction of core cardiac transcription factors Gata transcription factor 4 (Gata4) and NK2 homeobox 5 (Nkx2-5) were examined in study II. Specifically, the effects of GATA-targeted compounds on the differentiation of atrial and ventricular cardiomyoyctes were explored. Lead compound 3i-1000 increased the proportion of atrial and ventricular reporter cells after 10-day treatment in the spontaneous differentiation assay. Further exploration of the effects of GATA4 targeted compounds revealed that a shorter treatment (2-day) of cells prior to the onset of spontaneous beating led to an upregulation of ventricular reporter genes in a directed differentiation assay. An acetyl-lysine like domain among active compounds, in addition to analysis of the GATA4 interactome by Bio-ID revealed the potential association of bromodomain-containing proteins with chamber-specific gene expression. This was further investigated by combinatorial treatment with the Bromo- and Extra- Terminal domain family (BET) bromodomain inhibitor JQ1 and GATA-targeted compounds in reporter gene assays. Finally, the effects of GATA compounds on cardiomyocyte maturation were explored by compound treatment and global run-on sequencing (GRO-seq) in primary cardiomyocytes, revealing the upregulation of several targets previously identified as regulators of cell fate determination and regeneration. Study III detailed the embryonic/cardiac expression of proCholecystokinin (proCCK), a classical gut and neuropeptide. Analysis of mRNA-seq data suggested that proCCK is a transcriptional target of the TBX5 transcription factor in mESC-derived cardiomyocytes. Native, endogenous mRNA levels were characterized in embryonic hearts by whole mount in situ hybridization and optical projection tomography, revealing that proCck mRNA is present prior to the linear heart tube stage and that it is upregulated in the ventricles compared to the atria in the newly formed embryonic heart. Interestingly, mRNA of proCck and its receptors Cckar/Cckbr is mostly restricted to the atrial chambers in neonatal stages, in line with its potential role in regulating cardiac rhythm. In silico analysis implicated both TBX5 and MEF2C as regulators of proCck transcription, and this regulation was confirmed by conducting in vitro reporter gene assays. Additionally, proCCK was induced by endothelin-1 (ET-1), another peptide associated with maladaptive remodelling during heart failure. Furthermore, proCck mRNA levels declined in the left ventricles of rats following myocardial infarction (MI). Finally, exogenous cholecystokinin octapeptide (CCK-8) exerted no effects on the differentiation process of pluripotent stem cells (PSCs) to the cardiomyocyte fate. Collectively, these studies led to the generation of new methodology for the study of chamber-specific cardiac gene regulatory networks. Additionally, they led to an improved understanding of the dynamics of chamber-specific marker localization and upstream transcription factors governing their expression, potentially important to biomarker development. Finally, these studies have indicated that specific chemical compounds are capable of influencing chamber-specific gene regulatory networks. This knowledge might be utilized to develop novel therapeutic strategies for the treatment of heart failure. Geenisäätelyverkostojen häiriöt kammioissa ja eteisissä aiheuttavat niille tyypillisiä sydämen epämuodostumia ja synnynnäisiä sydänsairauksia. Aikuisten sydänlihasvaurioissa havaitaan sikiöaikaisten geenisäätelyverkostojen uudelleenaktivoitumista, joten näihin verkostoihin liittyvät transkriptiotekijät ovat mahdollisia lääkevaikutuksen kohteita sydämen vajaatoiminnan etenemisen hidastamisessa. Sydäntautien etiologian ymmärtämisen kannalta onkin oleellista tunnistaa spesifisesti kammioiden ja eteisten erilaistumista sääteleviä molekulaarisia tekijöitä. Lisäksi kemiallisten yhdisteiden molekulaaristen vaikutusten tutkiminen sydämen kehityksen aikana lisää tietoa niiden teratogeenisista ominaisuuksista, mikä voi johtaa uusien pienimolekyylisten yhdisteiden kehittämiseen kehitysbiologisten mekanismien aktivoimiseksi tai estämiseksi aikuisten sydämessä. Tämä väitöskirja koostuu kolmesta tutkimuksesta, jotka keskittyvät sydämen eteisten ja kammioiden sydänlihassolujen erilaistamiseen ja niiden erilaistumisen valikoivaan säätelyyn. Tutkimuksessa I kehitettiin in vitro-menetelmä pluripotenttien kantasolujen erilaistamiseksi eteis- ja kammiolihassoluiksi tutkimuksiin II-III. Alkion eteis- ja kammiokudoksen kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR)-analyysi vahvisti myosiinin kevyen ketjun 2 (Myl2) voimakkaan tarkkarajaisen ilmentymisen kammioissa ja osoitti myös endogeenisen eteisspesifisen merkkigeenin puuttumisen varhaisen alkion kehityksen aikana. Kammiosolujen tunnistamiseksi käytettiin geenimuokkausta integroimalla fluoresoiva merkkigeeni endogeeniseen Myl2-lokukseen, eteissolut puolestaan jäljitettiin eteisspesifisellä merkkigeenillä, jota ohjasi hidas myosiinin raskasketju 3 (SMyHC3)-promoottori. Eteisen ja kammion merkkigeenien ilmentyminen vahvistettiin in vivo laseravusteisella injektiolla morula-vaiheessa reportterihiiren alkion kantasoluihin (mESC) ja kimeeristen alkioiden mikroskopialla. Tämän in vivo -validoinnin lisäksi hiiren alkion kantasolujen, joihin oli integroitu merkkigeenit, spontaania erilaistumista tutkittiin qRT-PCR:llä, jolloin havaittiin ilmentymismuutoksia retinoiinihapon signaalitransduktiojärjestelmässä. Erilaistumismenetelmät kehitettiin perustuen kemiallisten yhdisteiden vaikutuksiin erilaistumattomiin esisoluihin ja erilaistuneisiin sydänlihassoluihin. Retinoidien, jotka ovat tunnettuja teratogeenejä ja säätelevät sydämen anteriorista -posteriorista akselia, vaikutuksia tutkittiin eteis- ja kammiomerkkigeenien aktiivisuuteen. Lisäksi kehitettiin kohdennettu erilaistamismenetelmä, joka perustui pelkkiin monipotentteisiin esisoluihin ja erilaistumisen arviointiin 384-kuoppalevyillä. Tässä menetelmässä Wnt:n ja transformoivan kasvutekijän β (Tgfβ) signaalireittien estäjät lisäsivät kammiomerkkigeenin ilmentymistä, kun ne lisättiin monipotenttisiin esisoluihin, mutta ei spontaanin sykkimisen alkamisen jälkeen. Lisäksi erilaistumattomiin esisoluihin lisätty eksogeeninen all-trans-retinoiinihappo esti kammioerilaistumista, kun taas spontaanin sykkimisen alkamisen jälkeen tapahtunut lisäys aktivoi kammiomerkkigeenin. Tutkimuksessa I kuvattujen pienimolekyylisten yhdisteiden lisäksi tutkimuksessa II tutkittiin uusia yhdisteitä, jotka vaikuttavat sydämen keskeisten transkriptiotekijöiden Gata4 ja Nkx2-5-proteiini-proteiini-vuorovaikutukseen. Erityisesti tutkittiin GATA4-kohdennettujen yhdisteiden vaikutuksia erikseen eteisten ja kammioiden sydänlihassolujen erilaistumiseen. Johtoyhdiste 3i-1000 lisäsi eteisen ja kammion merkkigeenisolujen osuutta 10 vuorokauden hoidon jälkeen spontaanissa erilaistamismenetelmässä. GATA4-kohdennettujen yhdisteiden vaikutusten jatkotutkimus osoitti, että lyhyempi solujen käsittely (2 vuorokautta) ennen spontaanin sykkimisen alkamista aktivoi kammioreportterigeenin kohdennetussa erilaistamismenetelmässä. Aktiivisten yhdisteiden asetyylilysiinin kaltainen domeeni, yhdessä GATA4-vuorovaikutus Bio-ID-analyysin kanssa, tuki bromodomeeniproteiinien mahdollista yhteyttä kammiospesifiseen geenien ilmentymiseen. Tätä yhteyttä tutkittiin edelleen merkkigeenimäärityksissä BET (Bromo- ja Extra-Terminal domain) bromodomeeniestäjän JQ1 ja GATA4-kohdennettujen yhdisteiden yhdistelmähoidolla. Lopuksi tutkittaessa GATA-kohdennettujen yhdisteiden vaikutuksia sydänlihassolujen kypsymiseen primaarisissa sydänlihassoluissa GRO-sekvensoinnilla (global run-on sequencing), havaittiin useiden solujen kehitykseen ja uusiutumiseen liittyvien geenien ilmentymisen lisääntyvän. Tutkimuksessa III kuvattiin prokolekystokiniinin (proCCK), klassisen suolisto- ja neuropeptidin, ilmentyminen alkiossa/sydämessä. mRNA-sekvenssitietojen analysointi viittasi siihen, että proCCK on hiiren alkion kantasoluista erilaistetuissa sydänlihassoluissa TBX5-transkriptiotekijän kohde. Kun endogeenisiä mRNA-tasoja tutkittiin alkion sydämissä in situ -hybridisaatiolla ja optisella projektiotomografialla, huomattiin että proCck-mRNA ilmentyy ennen lineaarista sydänputkivaihetta ja että sen ilmentyminen paikantui kehittyvässä hiiren alkion sydämessä lähinnä kammioihin verrattuna eteisiin. Kiinnostavaa oli myös, että sekä proCck:n että sen reseptorien, Cckar/Cckbr, mRNA rajoittui vastasyntyneisyysvaiheessa pääasiassa eteisiin, yhdenmukaisesti aikaisempien havaintojen kanssa joissa on todettu proCck:n säätelevän sydämen rytmiä. In silico -analyysi viittasi sekä TBX5:n että MEF2C:n merkitykseen proCck-transkription säätelijöinä; tämä löydös vahvistettiin in vitro merkkigeenimäärityksien avulla. Endoteliini-1 (ET-1), joka myös on yhdistetty sydämen vajaatoiminnan aikana tapahtuviin sydänlihaksen rakennemuutoksiin, indusoi proCCK:ta. Lisäksi havaittiin, että rottien vasemmassa kammiossa proCck-mRNA-tasot pienenivät kokeellisen sydäninfarktin jälkeen. Lopuksi todettiin, että kolekystokiniinioktapeptidi (CCK-8) ei vaikuttanut pluripotenttien kantasolujen erilaistumiseen sydänlihassoluiksi. Kokonaisuudessaan tutkimukset johtivat uuden menetelmän kehittämiseen sydämen kammiospesifisten geenisäätelyverkostojen tutkimiseen. Lisäksi tutkimustulokset lisäsivät käsitystä kammiospesifisten tekijöiden ajallisista ja paikallisista muutoksista sekä niiden ilmentymistä säätelevistä ylävirran transkriptiotekijöistä, mikä voi olla tärkeää biomarkkerien kehittämiselle. Lopuksi nämä tutkimukset osoittivat, että tietyt kemialliset yhdisteet vaikuttavat valikoivasti kammiospesifisiin geenisäätelyverkostoihin. On mahdollista, että tätä tietoa voitaisiin hyödyntää kehittäessä uusia lääkehoitoja sydämen vajaatoiminnan hoitoon. |
