| Přispěvatelé: |
University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Doctoral Programme in Sustainable Use of Renewable Natural Resources, Helsingin yliopisto, maatalous-metsätieteellinen tiedekunta, Uusiutuvien luonnonvarojen kestävän käytön tohtoriohjelma, Helsingfors universitet, agrikultur-forstvetenskapliga fakulteten, Doktorandprogrammet i hållbart utnyttjande av förnybara naturresurser, Riis Weisbjerg, Martin, Ahvenjärvi, Seppo, Huhtanen, Pekka, Vanhatalo, Aila |
| Popis: |
This work focuses on studying rapeseed meal (RM) protein degradation and utilization in dairy cows. Rapeseed meal was selected as a source of protein as it is widely used and cultivated in the European Union, and can be used to replace soybean meal in the rations of lactating dairy cows. This thesis comprises three experiments. Two experiments were conducted using in vitro and in vivo techniques. The objectives of the work were to establish an in vitro method to study protein metabolism in the rumen (Publications I and II), to study the metabolism of ammonia N and soluble fractions of RM protein in vivo (III), and to study the efficiency of utilization of different N fractions for milk protein synthesis (IV). The in vitro experiment documented in publication I involved a preliminary study to develop a mixture of carbohydrates to ensure high proteolytic activity and constant microbial N synthesis over the entire in vitro incubation period. In the main trial, the in vitro method was established to study the rate of ruminal degradation of RM protein based on observations of 14N and 15N isotope fluxes between ammonia N and non-ammonia N pools. In this study, feed protein was incubated with rumen fluid, mineral buffer and a carbohydrate mixture. The ammonia N pool was labelled with 15N isotope, and the incubations were carried out for 10 h with 11 sampling times. The rate of RM degradation estimated with a six-pool model was 0.06/h with an effective protein degradation of 0.38. This approach of studying protein degradation in vitro seemed to be appropriate for determination of microbial N synthesis from ammonia N but it did not provide sufficient information on metabolic events involved in ruminal protein degradation and microbial protein synthesis from preformed amino acids. A novel in vitro method developed to study the metabolism of soluble RM protein was presented in Publication II. In this experiment, unlabelled and 15N labelled soluble fractions of RM were incubated for 10 h with 11 sampling times along with buffered rumen fluid and a carbohydrate mixture. A four-pool model involving pools of 14N and 15N isotopes of ammonia N, soluble non-ammonia N, and insoluble-N from unlabelled and 15N labelled soluble RM incubations was used to estimate parameter values. The mean rate of soluble RM protein degradation was 0.126/h. There was no substantial difference in the rate of protein degradation and microbial N synthesis between the unlabelled and 15N labelled soluble RM. In conclusion, combined data from incubations of unlabelled and 15N labelled soluble RM provided sufficient information for estimation of parameter values in a complex dynamic model of soluble protein degradation. The results also indicated ruminal escape of soluble protein. The ruminal in vivo metabolism of 15N labelled ammonia N and a soluble N fraction of 15N labelled RM protein introduced into the rumen were presented in Publication III. Four lactating dairy cows equipped with rumen cannulae were used in this study. The cows consumed a total mixed ration (60% of silage and 40% of concentrates on DM basis) with 15.5% of crude protein on DM basis, with average rumen ammonia N concentration of 5.5 mg/100mL. The metabolism of ammonia N occurred at a very fast rate, with 99.4% of the original dose disappearing from the ammonia N pool in 4 h. The ammonia N was mainly incorporated into microbial N as 69% of the 15N labelled ammonia N dose disappeared from the rumen as microbial N. In the metabolism of soluble RM protein two steps were observed: 1) an almost instant uptake of more than half of the soluble non-ammonia N (SNAN) dose by the rumen bacteria 2) followed by slower degradation rate of the remaining fraction of the soluble RM protein. It was estimated that 8% of the soluble RM protein N escaped the rumen as feed N. SNAN had a higher initial uptake of the dose than ammonia N (AN) (56 vs. 16%). Also, the outflow as non-ammonia N from the rumen was higher for the SNAN than for AN treatment (89 vs. 69%). More N disappeared (outflow and absorption) from the rumen as ammonia N for the AN treatment than for SNAN treatment (31 vs. 11%). These observations suggested that SNAN was better utilized in the rumen than AN. Higher outflow of microbial N for the SNAN than for AN treatment (81 vs. 69%) indicated that preformed AA and small peptides stimulated microbial growth. The efficiency of utilization of AN, soluble and insoluble fractions of RM protein N for milk protein synthesis were described in Publication IV. The average efficiency of N utilization for milk protein synthesis (milk N/N intake) in this study (32%) was in the higher end of the range reported in the literature (typically from 14% to 36% but in some cases up to 45%). The cumulative secretion of isotope 15N in milk at 108 h post dose indicated that the three studied N fractions had different efficiency of N utilization for milk protein synthesis. The lowest efficiency of N utilization was estimated for AN (19%), followed by the soluble RM fraction (20%), and the highest efficiency of N estimated for the insoluble RM fraction (22%). These differences were smaller than could be expected based on the current protein evaluation systems. Keywords: dairy cows, soluble protein metabolism, ammonia, isotope 15N, rapeseed, efficiency of utilization of N for milk protein synthesis Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää rypsivalkuaisen aineenvaihduntaa ja hyväksikäyttöä lypsylehmien ruuansulatuksessa. Rypsivalkuainen valittiin tutkimus-kohteeksi sen vuoksi, että se on Euroopan Unionin alueella laajasti viljelty ja käytetty rehuvalkuainen, jonka avulla voidaan korvata soijarouheen käyttöä lypsylehmien valkuaisrehuna. Väitöskirja perustuu kolmeen kokeelliseen tutkimukseen, joista kahdessa käytettiin in vitro -menetelmiä ja yhdessä in vivo -menetelmiä. Kahden ensimmäisen tutkimuksen tavoitteena oli kehittää in vitro -menetelmä rehuvalkuaisen pötsiaineenvaihdunnan tutkimiseksi. Näiden tutkimusten tulokset on julkaistu väitöskirjan osajulkaisuissa I ja II. Kolmannen tutkimuksen tavoitteena oli selvittää ammoniumtypen sekä rypsin liukoisen valkuaistypen aineenvaihduntaa pötsissä. Lisäksi samassa tutkimuksessa selvitettiin ammoniumtypen ja rypsin valkuaistypen hyväksikäyttöä lypsylehmän maitovalkuaisen synteesissä. Kolmannen tutkimuksen tulokset on julkaistu väitöskirjan osajulkaisuissa III ja IV. Väitöskirjan ensimmäisessä osajulkaisussa esitettiin in vitro -menetelmä, joka oli kehitetty rypsivalkuaisen pötsiaineenvaihdunnan tutkimiseen. Menetelmä perustuu typen 14N- ja 15N-isotooppien virtauksien havainnointiin ammonium- ja ei-ammoniumtyppipoolien välillä. Esitutkimuksessa kehitettiin ensin pötsimikrobien energia-aineenvaihdunnan tarpeita varten hiilihydraattiseos, jonka tarkoituksena oli varmistaa optimaalinen pötsimikrobien proteolyyttinen aktiivisuus ja tasainen mikrobivalkuaisen synteesi koko 10 h kestävän in vitro -kokeen ajan. In vitro -kokeessa rypsivalkuaista inkuboitiin 10 h ajan pötsinesteen, kivennäispuskuriliuoksen ja hiilihydraattien seoksessa, jonka ammoniumtyppipooli oli leimattu 15N-isotooppia käyttäen. In vitro -kokeen aikana otettiin 11 näytettä, joiden perusteella saatuun havaintoaineistoon sovitettiin kuudesta poolista koostuva dynaaminen malli. Mallin avulla estimoitu rypsivalkuaisen hajotusnopeus pötsissä oli 0,06/h ja pötsihajoavuus 0,38. Tulosten perusteella in vitro -menetelmän arvioitiin soveltuvan mikrobisynteesin määrittämiseen, kun typpilähteenä on ammoniumtyppi, mutta menetelmän arvioitiin olevan riittämätön rehuvalkuaisen tai kokonaisten aminohappojen pötsiaineen-vaihdunnan tutkimiseen. Toisessa osajulkaisussa esitettiin uusi in vitro -menetelmä rypsivalkuaisen liukoisen fraktion pötsiaineenvaihdunnan tutkimiseksi. Tässä tutkimuksessa 15N-leimattua ja leimaamatonta rypsin liukoista valkuaisfraktiota inkuboitiin pötsinesteen, puskuriliuoksen ja hiilihydraattien seoksessa 10 h ajan. Havaintoaineisto perustui inkubaation aikana kerättyihin 11 näytteeseen, joista määritettiin 14N ja 15N suhteelliset osuudet ammoniumtyppipoolissa, liukoisessa ei-ammoniumtyppipoolissa ja liukenemattomassa typpipoolissa. Havaintoaineistoon sovitettiin neljästä poolista koostuva dynaaminen malli, jonka avulla rypsin liukoisen valkuaisen hajotusnopeudeksi pötsissä estimoitiin 0,126/h. Leimaamattoman ja 15N-leimatun rypsivalkuaisen välillä ei ollut merkittäviä eroja valkuaisen hajotusnopeudessa eikä mikrobisynteesin nopeudessa. Tulosten perusteella arvioitiin, että 15N-leimatun ja leimaamattoman rypsin liukoisen valkuaisen samanaikaisessa in vitro -inkubaatiossa saatiin riittävästi informaatiota useammasta tilamuuttujasta koostuvan dynaamisen mallin parametrien estimoimiseksi. Tulokset osoittivat, että lypsylehmän pötsistä virtaa hajoamatonta liukoista valkuaista alempaan ruuansulatuskanavaan. Osajulkaisussa III esitettiin in vivo -tutkimuksen tulokset 15N-leimatun ammoniumtypen ja rypsin liukoisen valkuaisfraktion aineenvaihdunnasta lypsylehmän pötsissä. Tutkimuksessa oli koe-eläiminä neljä pötsifistelöityä lypsylehmää, jotka söivät seosrehua, jonka kuiva-aineesta 60 % oli nurmisäilörehua ja 40 % väkirehuseosta. Dieetin raakavalkuaispitoisuus oli 15,5 % kuiva-aineessa ja lehmien pötsin ammonium-typpipitoisuus oli keskimäärin 5,5 mg/100 mL. Ammoniumtyppi metaboloitui pötsissä hyvin nopeasti siten, että lähes kaikki ammoniumtyppi (99,4 %) oli poistunut pötsinesteestä 4 h aikana. Suurin osa 15N-leimatusta ammoniumtypestä syntetisoitui mikrobitypeksi ja poistui pötsistä mikrobivalkuaisena (69 %). Liukoisen rypsivalkuaisen metaboliassa havaittiin kaksi vaihetta: 1) ensin yli puolet liukoisesta ei-ammoniumtypestä sitoutui lähes välittömästi pötsibakteereihin, ja 2) sen jälkeen jäljelle jäänyt solujen ulkoinen rypsin liukoinen valkuainen metaboloitui selvästi hitaammin. Tulokset osoittivat, että 8% rypsin liukoisesta valkuaisesta poistui pötsistä hajoamattomana rehuvalkuaisena. Ammoniumtyppeen verrattuna suurempi osa pötsiin annostellusta rypsin liukoisesta valkuaisesta sitoutui välittömästi mikrobivalkuaiseen (16 vs. 56 %). Lisäksi ammoniumtyppeen verrattuna suurempi osuus rypsin liukoisesta valkuaisesta virtasi ulos pötsistä ei-ammoniumtyppenä (69 vs. 89 %). Edelleen ammoniumtyppeen verrattuna pienempi osuus rypsin liukoisesta valkuaisesta poistui pötsistä ammoniumtyppenä ulosvirtauksen ja imeytymisen kautta (11 vs. 31 %). Näiden tulosten perusteella rypsin liukoisen valkuaisen hyväksikäyttö pötsissä oli tehokkaampaa kuin ammoniumtypen. Ammoniumtyppeen verrattuna suurempi osuus rypsin liukoisesta valkuaisesta virtasi pötsistä mikrobityppenä (69 vs. 81 %) osoittaen, että yksinkertaisiin typpiyhdisteisiin verrattuna aminohapot ja peptidit stimuloivat mikrobisynteesiä. Neljännessä osajulkaisussa esitettiin ammoniumtypen sekä liukoisen ja liukenemattoman rypsivalkuaistypen hyväksikäyttö lypsylehmien maitovalkuaisen synteesissä. Tässä tutkimuksessa valkuaistypen hyväksikäyttö oli keskimäärin 32 %. Tutkimuskirjallisuudessa valkuaistypen hyväksikäyttö on vaihdellut tyypillisesti 14 ja 36 % välillä ja korkeimmillaan hyväksikäyttö on ollut 45%. Tutkimuksessa määritettiin 15N-isotoopilla leimattujen typpifraktioiden kumulatiivinen eritys maidossa 108 h aikana. Tulokset osoittivat, että typpifraktioiden välillä oli eroja niiden hyväksikäytön tehokkuudessa. Ammoniumtypen hyväksikäyttöön verrattuna (19%) rypsin liukoisen valkuaisen hyväksikäyttö oli hieman suurempi (20%), mutta matalampi kuin rypsin liukenemattomalla fraktiolla (22 %). Erot typpifraktioiden välillä olivat kuitenkin pienempiä kuin nykyisten valkuaisen arviointijärjestelmien perusteella voitiin ennakoida. Asiasanat: lypsylehmä, liukoinen valkuainen, aineenvaihdunta, ammoniakki, 15N-isotooppi, typen hyväksikäyttö, maidontuotanto, maitovalkuainen |
