| Přispěvatelé: |
University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences, Division of General Microbiology, Helsingin yliopisto, bio- ja ympäristötieteellinen tiedekunta, biotieteiden laitos, Helsingfors universitet, bio- och miljövetenskapliga fakulteten, biovetenskapliga institutionen, Haataja, Sauli, Korhonen, Timo K. |
| Popis: |
Omptins are a family of conserved, integral outer membrane proteases and widely distributed within Gram-negative bacterial species. The family offers a good example of the evolution and the adaptation of a protein to novel functions and to differing pathogenic bacterial life-styles. This work investigates three different omptins: Pla of Yersinia pestis, PgtE of Salmonella enterica and OmpT of Escherichia coli. The omptin proteases differ in substrate specificity and need lipopolysaccharide (LPS) for activity. My thesis work addressed two main questions in omptin function: what is the molecular basis of the dissimilar substrate selectivity in the structurally very similar omptins; and what are the structural features in LPS that affect omptin activity. I studied the LPS dependency of omptins by expressing the proteins in bacterial cells that differ in LPS structure and by reconstituting purified, detergent-solubilized omptin protein with characterized, purified LPS molecules. Y. pestis alters its LPS structure in response to change of temperature from 20°C to 37°C, which reflects the transfer from a flea to a mammalian host. I found that the activity of Pla in cells from 20°C was very low, whereas cells from 37°C expressed high activity. I reconstituted detergent-purified His6-Pla protein with various model LPS structures and with LPSs of Y. pestis grown at different temperatures. Adding Y. pestis LPS from 37°C to the nonfunctional Pla protein induced high proteolytic activity, whereas 20°C-LPS gave very low activity, indicating that the activity of Pla is controlled by LPS. Similarly, I found that the activity of PgtE was high with rough LPS and low with smooth LPS; the difference mimics the LPS of intracellular (rough) and extracellular (smooth) S. enterica. Thus, in both bacterial species the omptin activity is controlled by the LPS type that the bacteria express during infection in mammals. I further studied the fine structure of Y. pestis LPS that affects Pla activity. This was done by reconstituting Pla activity with various structurally characterized Y. pestis and E. coli LPSs. I found that lower levels of lipid A acylation and phosphate substitution by aminoarabinose, are important for Pla activity, these features are characteristic for Y. pestis LPS from 37°C. A common and conserved feature in omptin structure is the presence of LPS-binding motif in protein barrel. Disrupting of the lipid A-binding motifs in PgtE and Pla abolished their proteolytic activity, emphasizing the importance of the LPS binding site for omptin activity. Omptins have a highly spatically conserved active center and catalytic domains but express functional heterogeneity. The omptin transmembrane barrel contains five surface-exposed loops that show slightly higher sequence variation than the transmembrane protein regions. To study the effect of loop structures in omptin proteolytic specificity, I changed OmpT of E. coli to a Pla-like enzyme by a stepwise substitution of the loop areas. The proteins were characterized by their ability to activate the human protease precursor plasminogen(Plg) to the active serine protease plasmin and to inactivate the main plasmin inhibitor, α2-antiplasmin(α2AP); both functions are important for bacterial virulence. Pla cleaves very efficiently both substrates, whereas OmpT is only poorly active with them. I showed that OmpT could be converted into a Pla-like enzyme by cumulative substitutions at the loop areas, especially the loops L3-L5 were important. The successful conversion of OmpT towards Pla indicates that the loop structures are critical for omptin activity by allowing correct recognition of the polypeptide substrate. More detailed substitution analysis was taken to identify the catalytic residues in Pla. My thesis demonstrates that the omptin proteolytic activity depends on two things: their specific interaction with LPS and the structure of their surface-exposed loops. The thesis offers an example of omptins extensive evolvability and of how they adapt to the lifestyle of their host bacterium. Väitöskirjassani on käsitelty kolmen bakteerilajin solupinnan proteaaseja, eli proteiineja, jotka pystyvät hajottamaan muita proteiineja. Näitä proteaaseja kutsutaan omptiineiksi ja ne ovat rakenteellisesti hyvin samankaltaisia tynnyrin muotoisia bakteerin ulkokalvon läpäiseviä proteiineja. Yersinia pestis, Salmonella enterica ja Escherichia coli ovat patogeenisia bakteereita, joiden aiheuttaman taudinkuva vaihtelee lajikohtaisesti. Y. pestis on voimakas patogeeni ja ruton aiheuttaja. Tautia esiintyy edelleen yksittäisinä tapauksina miltei jokaisella mantereella. Infektio välittyy yleensä infektoituneen kirpun pureman kautta nisäkkääseen. S. enterica aiheuttaa lievempiä suolistoinfektioita, mutta myös vakavamman lavantautitartunnan. Infektio saadaan yleensä ulosteperäisesti saastuneen ruoan tai veden välityksellä. E. coli on yleinen bakteeri ihmisen suoliston normaalifloorassa. Se on yleensä harmiton, mutta voi aiheuttaa suolisto- ja virtsatietulehduksia. Työssä tutkittiin tekijöitä, jotka vaikuttavat Y. pestiksen Pla-, S. enterican PgtE- ja E. colin OmpT proteaasien kykyyn tunnistaa kohdeproteiininsa eli substraattinsa, sekä lipopolysakkaridin (LPS) rakenteellisia ominaisuuksia, jotka vaikuttavat omptiinien aktiivisuuteen. Tutkimuksessa havaittiin omptiini-proteiinien bakteerin solukalvon ulkopinnalle ulottuvien silmukkarakenteiden olevan tärkeitä kohdeproteiinin tunnistuksessa ja omptiinien väliset eroavuudet silmukoissa vaikuttivat proteaasien kykyyn tunnistaa substraatti. Työssä selvitettiin myös Pla:n konservoituneen, aktiivisen keskustan katalyyttiset aminohapot. Gram-negatiivisilla bakteereilla on solukalvollaan myös LPS molekyylejä, joiden on havaittu vaikuttavan omptiinien aktiivisuuteen. Y. pestiksen infektoidessa kirpun tai nisäkkään, sen LPS:n rakenne on riippuvainen isännän elimistön lämpötilasta, mikä kirpulla on 27°C ja nisäkkäällä 37°C. Pla:n aktiivisuuden huomattiin olevan paljon alhaisempi Y. pestis soluissa, jotka olivat kasvatettu 20°C, kun taas 37°C solut olivat hyvin aktiivisia. Samanlainen tulos saatiin myös puhdistetulla ei aktiivisella Pla:n proteiinilla, joka aktivoitiin eri lämpötiloissa kasvaneiden Y. pestis bakteerien soluista eristetyillä LPS-preparaateilla. LPS:n rakenne vaikutti myös PgtE:n aktiivisuuteen. PgtE:n aktiivisuus vaati LPS-molekyylin, jolla on lyhyt sivuketju. Pitkä LPS:n O-sivuketju puolestaan esti PgtE:n substraatin pääsyn proteaasin aktiiviseen keskustaan. Tämä vastaa S. enterican LPS:n muotoja silloin kun bakteeri on makrofaagi-solun sisällä (lyhyt LPS) ja solun ulkopuolella (pitkä LPS). Y. pestiksen LPS:n rakennemuutoksien vaikutusta Pla:n aktiivisuuteen tutkittiin tarkemmin ja huomattiin LPS:n lipidi A:n 37°C tapahtuvien muutosten lisäävän Pla:n aktiivisuutta. Omptiineilla on konservoitunut LPS:n sitoutumiskohta. Tämän alueen aminohappojen muuttaminen poisti PgtE:n ja Pla:n aktiivisuuden ja korosti LPS:n sitoutumisen merkitystä proteiinin toiminalle. Tämä työ tarjoaa esimerkin proteiinien evoluutiosta ja niistä mekanismeista, joilla omptiini proteiinit ovat sopeutunut isäntä bakteerinsa elintapaan. Jokainen näistä kolmesta omptiinista, Pla, PgtE ja OmpT lisäävät bakteerin taudinaiheuttamiskykyä ja selvitymistä, mutta eri keinoin. |
