| Přispěvatelé: |
University of Helsinki, Faculty of Medicine, Medicum, Centre for Military Medicine, Research and Development Department, University of Helsinki, Doctoral Programme in Microbiology and Biotechnology, Helsingin yliopisto, lääketieteellinen tiedekunta, Medicum, Helsingfors universitet, medicinska fakulteten, Medicum, Sebbane, Florent, Skurnik, Mikael, Nikkari, Simo |
| Popis: |
A biological threat is an epidemic or its threat caused by a microbe or biological material of a magnitude that would overwhelm healthcare services due to the contagiousness or wide distribution of infections. A biological threat can be naturally occurring, such as the West African Ebola epidemic of 2014-2016, or the consequence of an intentional release of a microbe or toxin. The aim of this thesis was to develop and use molecular methods in order to reliably and rapidly identify potential biological threat agents. The focus was on the detection and typing of biological threat agents, whether they are naturally occurring or intentionally released. Different molecular methods were used: polymerase chain reaction (PCR) to detect and differentiate pathogenic from non-pathogenic bacterial strains, 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing to investigate polymicrobial samples, and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) spacer comparison for bacterial strain typing. Cholera, a disease caused by Vibrio cholerae bacterium, is a major public health problem worldwide and a potential bioterrorism agent, according to the Centers for Disease Control and Prevention (CDC). In this thesis, an accurate PCR-based method was developed to detect V. cholerae strains: one assay for pathogenic strains and another for all V. cholerae strains. In addition, three different PCR platforms were compared. The PCR assays proved to be suitable for the reliable identification and differentiation of V. cholerae strains. The PCR platforms gave identical results, which indicate that the assays can be transferred between the platforms while maintaining sufficient sensitivity and specificity. Two 16S rRNA gene-based detection methods, using Sanger sequencing or pyrosequencing, were employed to study the presence of bacterial residues in carotid artery tissue samples and in livers of splenomegalic voles. The objectives were to observe the utility of the two methods and compare their performance. Both methods were found to be convenient approaches to detect and identify bacterial species present in different matrices and thus could be employed when investigating polymicrobial samples. In addition, the two methods gave similar results which emphasises the reliability of the methods and their results. The Yersinia genus includes three human pathogens; Y. pestis, the causal agent of plague and a potential biothreat agent, as well as Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis, which commonly cause self-limiting enteritis. Due to the high level of DNA similarity between Y. pestis and Y. pseudotuberculosis, typing of Yersinia species and distinguishing them from each other has been challenging. Here, CRISPR spacers were used for typing Yersinia pseudotuberculosis complex strains. This method proved to be a promising tool, although the large diversity of different spacer sequences hindered the clustering of different strains. In addition, CRISPR data of Y. pseudotuberculosis and Y. pestis were compared to examine phylogenetic relationships, but surprising lack of shared spacers limited any further resolution from being made. In this thesis, molecular methods were developed and used to detect, identify, and type potential biological threat agents. PCR assays developed can be transferred to a field-deployable instrument and thus employed close to the patient, for example, during epidemics. PCR results were ready within a few hours, enabling a rapid and appropriate medical response. The 16S rRNA gene-based methods can be utilized in detection of biological agents, which are challenging or laborious to identify using traditional methods. The CRISPR-based sequencing method can be used for typing different strains of Y. pseudotuberculosis, if a comprehensive reference database is made available. DNA sequencing and recently next-generation sequencing have become powerful tools to identify and type biological agents. Sequencing methods can also be utilized in epidemiological investigations and source tracking. Different molecular methods have evolved recently and detection has become fast and more reliable. Rapid detection of microbes enables swift medical countermeasures, and accurate identification and typing methods facilitate the ability to distinguish a natural outbreak from an intentional release. Mikrobin tai biologisen materiaalin aiheuttamaa epidemiaa tai sen uhkaa kutsutaan biologiseksi uhkaksi, silloin kun tauti ei tartuntavaaransa vuoksi ole yhteiskunnan normaaliresurssein hoidettavissa tai kun kyseessä on laaja epidemia, jonka hallitsemiseen tavanomaiset resurssit eivät riitä. Biologinen uhka voi olla luonnollinen, kuten esimerkiksi Länsi-Afrikan laaja ebolaepidemia vuosina 2014-2016, tai tahallinen mikrobin tai toksiinin levittäminen. Väitöskirjan tavoitteena oli kehittää ja hyödyntää molekyylibiologisia menetelmiä biologisten uhka-agenssien nopeaa ja luotettavaa tunnistamista varten. Työn tarkoituksena oli tunnistaa ja tyypittää biologisia uhka-agensseja, olivat ne sitten luonnollisia ja tahallisesti levitettyjä. Työssä hyödynnettiin polymeraasiketjureaktiota (PCR) bakteerien tunnistamisessa sekä tautia aiheuttavien ja vaarattomien bakteerikantojen erottelussa toisistaan. Lisäksi käytettiin hyväksi 16S ribomaalisen RNA (rRNA) -geenin sekvensointia tutkittaessa polymikrobisia näytteitä, ja Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) -geenialueiden vertailua bakteerien tyypityksessä. Kolera, Vibrio cholerae -bakteerin aiheuttama tauti, on maailmanlaajuisesti suuri kansanterveydellinen ongelma. Lisäksi Yhdysvaltain tartuntatautivirasto CDC (Centers for Disease Control and Prevention) on luokitellut V. cholerae -bakteerin yhdeksi potentiaaliseksi biouhka-agenssiksi. Työssä kehitettiin kahteen polymeraasiketjureaktioon perustuva V. cholerae -bakteerin tunnistusmenetelmä. Toisen menetelmän avulla pystytään tunnistamaan kaikki V. cholerae -kannat ja toinen havaitsee vain tautia aiheuttavat kannat. Lisäksi työssä vertailtiin kolmea eri PCR-laitetta. Työssä kehitetyt tunnistusmenetelmät osoittautuivat käyttökelpoisiksi ja luotettaviksi tunnistettaessa ja eroteltaessa V. cholerae -kantoja. Käytetyt PCR-laitteet antoivat samanlaiset tulokset, mikä mahdollisti tunnistusmenetelmän siirtämisen laitteiden välillä ilman, että sillä oli vaikutusta menetelmän herkkyyteen tai spesifisyyteen. Kahta erillistä 16S rRNA -geeniin perustuvaa menetelmää yhdistettynä Sanger- ja pyrosekvensointiin hyödynnettiin tutkittaessa bakteerijäämiä kaulavaltimokudoksesta ja myyrien maksanäytteistä. Tavoitteena oli tutkia menetelmien käytettävyyttää ja vertailla menetelmiä toisiinsa. Käytetyt menetelmät osoittautuivat soveltuviksi bakteerilajien havaitsemiseen erilaisista näytematriiseista ja menetelmiä pystytään hyödyntämään tutkittaessa polymikrobisia näytteitä. Lisäksi käytetyt kaksi eri menetelmää tunnistivat samoja bakteerisukuja samoista näytteistä, mikä lisää menetelmien ja tulosten luotettavuutta. Yersinia-bakterien sukuun kuuluu kolme ihmisille tautia aiheuttavaa lajia; Y. pestis, ruton aiheuttaja ja potentiaalinen biouhkabakteeri sekä Y. enterocolitica ja Y. pseudotuberculosis, jotka aiheuttavat suolistotulehduksia. Koska Y. pestis ja Y. pseudotuberculosis -bakteerien genomit ovat hyvin samanlaisia, kantojen tyypittäminen ja erottaminen toisistaan on haastavaa. Tässä työssä CRISPR spacer -geenialueita hyödynnettiin Yersinia-suvun kantojen tyypittämisessä. Tyypitysmenetelmä osoittautui lupaavaksi työkaluksi, vaikka toisistaan eroavien spacer-sekvenssien laaja kirjo vaikeutti kantojen ryhmittämistä ja vertailua. Lisäksi Y. pestis ja Y. pseudotuberculosis -kantojen fylogeneettistä suhdetta tutkittiin vertailemalla kantojen spacer-sekvenssejä. Yllättäen lajeilla oli hyvin vähän yhteisiä spacereita. Näin ollen tutkimus ei tuonut lisätietoa kantojen fylogeneettisistä suhteista. Väitöskirjassa hyödynnettiin molekyylibiologisia menetelmiä potentiaalisten biologisten uhka-agenssien osoittamisessa, tunnistamisessa ja tyypittämisessä. Kehitetty PCR-menetelmä pystyttiin siirtämään kenttäkelpoiselle PCR-laitteelle, mikä tekee mahdolliseksi laitteen käyttämisen lähellä potilasta esimerkiksi epidemian aikana. Tulokset olivat valmiina muutamissa tunneissa, mikä mahdollistaa nopeat lääkinnälliset toimenpiteet. Lisäksi bakteerien 16S rRNA-geenialueen sekvensointiin perustuvia menetelmiä pystytään hyödyntämään sellaisten biologisten agenssien seulonnassa ja tunnistamisessa, joiden identifiointi tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi viljelemällä, olisi haastavaa tai työlästä. CRISPR-geenialueeseen perustuvaa menetelmää pystyttäisiin hyödyntämään bakteerien tyypityksessä, mikäli laaja referenssitietokanta olisi käytettävissä. DNA:n sekvensointi ja viime vuosina varsinkin uuden sukupolven sekvensointimenetelmät ovat osoittautuneet käyttökelpoisiksi työkaluiksi biologisten agenssien tunnistamisessa ja tyypittämisessä. Sekvensointimenetelmiä pystytään hyödyntämään myös epidemiologisissa tutkimuksissa ja selvitettäessä taudinaiheuttajan alkuperää. Erilaiset molekyylibiologiset menetelmät ovat kehittyneet valtavasti viimevuosina ja taudinaiheuttajien tunnistamisesta on tullut nopeaa ja luotettavaa. Nopea tunnistaminen luo perustan lääkinnällisten vastatoimien aloittamiselle. Tarkka tunnistaminen ja tyypittäminen antavat myös mahdollisuuden erottaa tahallinen levitys luonnollisesta epidemiasta. |
