| Přispěvatelé: |
University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Faculty of Pharmacy, Centre for Drug Research, Division of Pharmaceutical Biosciences, Helsingin yliopisto, farmasian tiedekunta, Helsingfors universitet, farmaceutiska fakulteten, Roda, Aldo |
| Popis: |
Due to the emergence of multidrug resistant bacteria, bacterial infections are still a major healthcare problem. Many factors have led to a discovery void of new antibacterial agents, rendering the current antibiotic pipeline inadequate for future medical needs. For example, the outcomes from pure biochemical high-throughput screening (HTS) assays have, in many cases, not led to successful clinical compounds. Therefore cell-based assays might be a better choice for primary screening. However, the antibacterial cell-based assays in the current use often require long incubation times and they are not always amenable for miniaturization and automation for HTS. In this work, two screening assays based on recombinant bioluminescent E. coli strains were optimized and implemented in the screening of chemical libraries and natural products in antibacterial drug discovery. One of the recombinant bacterial strains was a strain which is sensitive towards transcriptional and translational inhibitors. The assay based on this strain was successfully miniaturized into 384-format using automatized liquid handling and was validated with a proof-of-concept library containing known drugs. This provided a means to perform a larger scale high throughput screen of a compound library. Based on the HTS hit structures, a ligand-based in silico screening of a virtual chemical library was employed for hit enrichment. The most active hits and the in silico selected compounds were further investigated in more detail. Natural products have been an important source in drug discovery, especially in the discovery of antibiotics in the current use. However, matrix effects such as colour or turbidity of natural product extracts can potentially cause interference in conventional absorbance based microbial growth inhibition assays. Also, conventional antibacterial assays are usually not sensitive enough for detecting very small concentrations in fractionated natural product extracts. The feasibility of bioreporter -based assays in antimicrobial screening of natural products was demonstrated by screening an in-house natural product library. One of the assays was also implemented for investigating the antibacterial properties of an extract from a fungal culture filtrate, which demonstrated the sensitivity of the assay for identification of active components from fractionated samples. In conclusion, sensitive and reproducible bioassays amenable for further miniaturization and automation were developed for antibacterial drug discovery. Compared to conventional antimicrobial testing, the bioreporter-based methods offer important improvements such as simultaneous data acquirement on antimicrobial activity, first indication of mode of action and significant reduction of assay time to 2-4 h compared to 24 h in standard susceptibility assays. The developed bioluminescent assays led to the improvement of compound throughput in antimicrobial screening: from hundreds of samples (natural product extracts and fractions) in manually performed assays in 96-well plates, to thousands of test compounds (synthetic compound libraries) in 384-well format using automated liquid handling. På grund av uppkomsten av multiresistenta bakterier är bakterieinfektioner fortfarande ett stort hälsoproblem. Många faktorer har lett till att den nuvarande upptäckten av nya antibakteriella medel är otillräcklig för framtida medicinska behov. Till exempel, har sållingsmetoder baserade på enbart kända antibakteriella målproteiner inte lett till upptäckten av tillräckligt många nya antibakteriella föreningar. Därför kan cellbaserade metoder vara ett bättre val för primärsållning av molekyler för upptäckten av nya potentiella föreningar för läkemedelsutveckling. Emellertid, kräver de nuvarande standardmetoderna som används i antibakteriella analyser ofta långa inkubationstider. Metoderna är inte heller alltid lämpade för miniatyrisering och automation för sållning av stora molekylbibliotek i laboratorieförhållanden. Naturprodukter har varit en viktig källa i läkemedelsutveckling, särskilt i upptäckten av antibiotika som används idag. Ibland kan färgen eller grumligheten av naturprodukternas extrakt orsaka störningar i standardmetoderna. De konventionella metoderna är ibland inte tillräckligt känsliga för att upptäcka mycket små koncentrationer av aktiva ämnen som finns t.ex. i fraktionerade naturprodukter. I denna avhandling utvecklades känsliga och reproducerbara sållingsmetoder som ytterligare miniatyriserades, automatiserades och implementerades i sållning av kemiska bibliotek. Därtill undersöktes även användingen av dessa så kallade bioreportermetoder i antibakteriell sållning av naturprodukter. Lämpligheten påvisades genom att testsålla ett bibliotek av växtextrakt samt en undersökning av de antibakteriella egenskaperna hos ett extrakt av en svampkultur. Sållningsmetoderna var baserade på två olika genmodifierade bioluminescenta (självlysande) E. coli bakteriestammar. En av de bakteriestammarna som användes var specifik för upptäckten av proteinsyntes inhiberare (transkription och translation). Metoden miniatyriserades till 384-microtiterplattor och med hjälp av automatiserad vätskehantering bekräftades metodens tillförlitlighet genom en testsållning av ett bibliotek innehållande kända läkemedel. Därefter användes den automatiserade metoden till att utföra en sållning av ett molekylbibliotek i en större skala. Baserat på de strukturer som identifierades som mest aktiva, gjordes även en datorbaserad sållning av ett virtuellt kemiskt bibliotek för att hitta liknande strukturer. De utvalda föreningarna undersöktes vidare i närmare detalj. Med hjälp av dessa metoder kan förbättringar i den antibakteriella sållningen åstadkommas, såsom samtidig detektion av antimikrobiell aktivitet, första indikation på verkningssätt och betydande minskning av analystiden till 2-4 timmar jämfört med 24 timmar i standardmetoder. Miniatyrisering och optimeringen av metoderna ledde till att analysmängden kunde utökas från hundratals prover i manuellt utförda analyser till tusentals föreningar med hjälp av automatiserad vätskehantering. |
