| Popis: |
O monóxido de carbono (CO) endógeno exerce vários papéis biológicos: anti-in-flamatório, anti-apoptótico, vasodilatador, antiproliferativo e modulador do metabo-lismo celular. O CO exógeno pode ser aplicado através das CO-releasing molecules (CORMs) que libertam CO de forma controlada. No sistema nervoso central, nomeada-mente nos astrócitos, sabe-se que o efeito citoprotetor do CO tem como alvo as mito-côndrias. As mitocôndrias são importantes no metabolismo, mas também geram espé-cies reativas de oxigénio, que podem ser sinaliza-doras ou levar a stress oxidativo. Assim, um desequilíbrio mitocondrial pode promover dano oxidativo, representando uma ame-aça à sobrevivência celular. A mitofagia (a autofagia específica das mitocôndrias) está fortemente envolvida na regulação da dinâmica mitocondrial, juntamente com a produ-ção de novas mitocôndrias (biogénese mitocondrial). Dados em astrócitos, previamente gerados no laboratório, mostram que o CO induz mitofagia e biogénese mitocondrial. Tendo em conta estes dados este projeto pretende demonstrar a interdependência dos dois processos biológicos utilizando cultura primária de astrócitos de murganho e a mo-lécula libertadora de CO, CORM-A1. Foi possível observar através da análise dos níveis de expressão do co-ativador de transcrição PGC-1α que o CO induziu a biogénese mito-condrial em astrócitos após a exposição de 12,5μM de CORM-A1 durante 1 hora. Ainda assim a quantidade de DNA mitocondrial não se alterou após o tratamento com CO referido, o que indica que o processo de replicação do DNA mitocondrial é posterior ao aumento de PGC-1α. Num próximo passo silenciou-se a expressão de genes das vias de mitofagia PINK1 e BNIP3 e analisou-se de novo a biogénese mitocondrial. Os resultados demostraram tendências diferentes entre as amostras silenciadas para PINK1 e para BNIP3 indicando que são independestes entre si. A tendência dos resultados sugere que PINK1 é a via principal de estimulação da mitofagia por parte do CO. Foram usadas ainda duas linhas celulares de neurónios humano. As linhas celulares SH-SY5Y MitoQC e SH-SY5Y MitoTimer foram expostas a CO de modo verificar se existia alguma alteração na mitofagia e na biogénese mitocondrial. Apesar de alguns resultados serem ainda preli-minares é possível dizer com alguma reserva que os processos mitofagia e biogénese estão interligados e são dependentes. Porém são necessários mais estudos para que se possa descobrir como esta interdependência pode ocorrer. Endogenous carbon monoxide (CO) has several biological roles: anti-inflammatory, anti-apoptotic, vasodilator, anti-proliferative, and modulator of cellular metabolism. Ex-ogenous CO can be delivered through CO-releasing molecules (CORMs) that release CO in a controlled manner. In the central nervous system, particularly in astrocytes, the cy-toprotective effect of CO is known to target mitochondria. Mitochondria are important in metabolism, but they also generate reactive oxygen species, which can be signaling or lead to oxidative stress. Thus, a mitochondrial imbalance can promote oxidative damage, being a threat to cell survival. Mitophagy (the specific autophagy of mitochondria) is strongly involved in the regulation of mitochondrial dynamics, along with the production of new mitochondria (mitochondrial biogenesis). Data in astrocytes, previously gener-ated in the laboratory, show that CO induces mitophagy and mitochondrial biogenesis. Considering these data, this project intends to demonstrate the interdependence of the two biological processes, using primary cultures of mouse astrocytes and a CO-releasing molecule, CORM-A1. It was possible to observe through the analysis of the expression levels of the transcription coactivator PGC-1α that CO induced mitochondrial biogenesis in astrocytes after exposure to 12.5μM of CORM-A1 for 1 hour. Even so, the amount of mitochondrial DNA did not change after the mentioned CO treatment, which indicates that the mitochondrial DNA replication process is subsequent to the increase in PGC-1α. In a next step the expression of genes of the PINK1 and BNIP3 mitophagy pathways was silenced and the mitochondrial biogenesis was analyzed again. The results showed different trends between the silenced samples for PINK1 and for BNIP3, indicating that they are independent of each other. The trend of the results suggests that PINK1 is the main pathway of mytophagy stimulation by the CO. Two further human neuronal cell lines were also used. The SH-SY5Y MitoQC and SH-SY5Y MitoTimer cell lines were ex-posed to CO to verify if there was any change in mitophagy and mitochondrial biogen-esis. Although some results are still preliminary, it is possible to say with some reservation that the mitophagy and biogenesis processes are interconnected and dependent. How-ever, further studies are needed to discover how this interdependence can occur. |
