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Planorbarius metidjensis e Bulinus truncatus, identificados como hospedeiros intermediários de Schistosma haematobium e S. bovis, foram o objecto do nosso estudo. Este trabalho está dividido em seis capítulos que de certo modo, se encontram relacionados entre si. No Capítulo 1, faz-se uma abordagem geral sobre estas duas espécies de moluscos com importância em medicina, com breves considerações sobre a sua classificação, características morfológicas e distribuição no mundo e em Portugal. Do mesmo modo, a revisão de literatura realça aspectos importantes relacionados com interacção do molusco, hospedeiro intermediário e o tremátode parasita e a aplicação das novas técnicas moleculares nesta área. No intuito de rever a distribuição geográfica destas duas espécies de moluscos em Portugal continental, foi realizado um levantamento malacológico em vários distritos, cujos resultados são apresentados no Capítulo 2. Os distritos em estudo foram Beja, Coimbra, Évora, Faro, Guarda, Lisboa, Portalegre, Setúbal e Viseu, tendo sido colhidos 3219 exemplares de P. metidjensis, enquanto para B. truncatus não foi encontrado nenhum exemplar. Por isso, a segunda parte do trabalho decorreu com exemplares de B. truncatus, mantidos há várias gerações no Laboratório de Malacologia da Unidade de Helmintologia e Malacologia Médicas, e tendo origem em exemplares colhidos pela Profª Doutora Maria Amélia Grácio, Directora da Unidade. Ainda neste capítulo e com base nos dados recolhidos, foi feita a caracterização dos habitats segundo o seu tipo físico, natureza e aspectos bioecológicos. No Capítulo 3, destaca-se a variabilidade encontrada nas características morfométricas da concha de P. metidjensis nos diferentes distritos, o que permitiu evidenciar dois grupos distintos. O primeiro engloba as regiões do Alentejo, Algarve e Estremadura e o segundo, as regiões das Beiras e Sado. O tipo físico dos habitats e as características das conchas dos moluscos colhidos parecem ser os factores explicativospara esta similaridade. Neste capítulo também é feita uma abordagem sobre a dinâmica populacional de quatro habitats seleccionados com base nas características físicas de cada um deles (dois do distrito de Évora e dois do distrito de Faro). No Capítulo 4, estudam-se os moluscos em relação a uma eventual infecção natural por tremátodes, bem como, a sua susceptibilidade à infecção por Schistosoma haematobium (estirpe de Angola) e S. mansoni (estirpe do Brasil). No total de 3219 P. metidjensis examinados, 1456 (45,2%) eliminaram xifideocercárias. Quanto à susceptibilidade de P. metidjensis a S. haematobium, os resultados vieram, mais uma vez, confirmar a não susceptibilidade desta espécie de moluscos à estirpe angolana de S. haematobium. Em relação a S. mansoni, alguns exemplares de P. metidjensis desenvolveram infecção até à fase de esporocisto, apesar de não chegarem a eliminar cercarias. Estes resultados não se verificaram nos moluscos B. truncatus. No Capítulo 5, é feito pela primeira vez, um estudo molecular de P. metidjensis. Neste estudo foram usados exemplares de P. metidjensis de diferentes habitats e agrupados em cinco distritos, para analisar a sua posição sistemática e relação filogenética com outras espécies homólogas cujas sequências se encontram no GenBak. Nesta análise foram usadas as sequências parciais dos genes mitocondriais COI e 16S, tendo-se identificado um total de nove haplotipos para o gene COI e quatro para o gene 16S. Estes resultados mostraram que o maior número de haplotipos foi encontrado no distrito de Coimbra, para ambos os genes, significando que os habitats deste distrito foram mais polimórficos que os restantes. Com base nos resultados obtidos para os genes COI e 16S, P. metidjensis de Portugal apresentaram uma elevada homologia (81%) com outras espécies de Planorbarius spp, bem como, com espécies de Biomphalaria spp das regiões Neotropical e Africana, hospedeiros intermediários de S. mansoni e de outros tremátodes. Para avaliar qual o grau de diversidade genética de P. metidjensis foram usados marcadores de RAPD nos moluscos colhidos em 19 habitats (de nove distritos). Os resultados evidenciaram não só uma elevada variabilidade genética, determinada pelo Índice de Shannon (Ho=0,4981),como também, uma alta diferenciação genética (Gst=0,238) inter e intrapopulacional (de acordo com os pressupostos de Wright, 1978). À semelhança do capítulo anterior, no Capítulo 6, faz-se pela primeira vez uma caracterização molecular de B. truncatus de Portugal. Como já foi referido anteriormente, não foi possível colher exemplares desta espécie durante o trabalho de campo, por isso este estudo realizou-se com as populações mantidas no laboratório. Os resultados do estudo, em que se aplicou a técnica de RAPD, evidenciaram uma elevada diferenciação genética entre as populações (Gst=0,28), assim como, uma elevada variabilidade genética intrapopulacional determinada pelo Índice Shannon (0,5294 ± 0,1787) a qual parece estar relacionada com o baixo número de migrantes. Foram também utilizados como marcadores moleculares o gene COI do ADN mitocondrial e ITS (Região Interna Transcrita) do ADN ribossomal para análise da posição sistemática e relação filogenética com outras espécies homólogas (hospedeiras intermediárias de Schistosoma spp) cujas sequências se encontram no GenBank, as quais evidenciaram homologia muito elevada com as espécies B. truncatus (Sudão) e B. tropicus. Além disso, foi identificado um total de sete haplotipos para a região ITS e nove para o gene COI, sendo a população de moluscos de Estói a que apresentou três haplotipos, enquanto as restantes populações apresentaram quatro haplotipos distintos. Os resultados globais para Fst foram muito baixos, sugerindo tratar-se de uma mesma população. The object of our study were Planorbarius metidjensis and Bulinus truncatus, identified as the intermediate hosts of Schistosoma haematobium and S. bovis. This work is divided into six chapters that are to an extent related with one another. Chapter 1 are general considerations regarding these two species of mollusc with importance in medicine, including brief considerations about its classification, morphological characteristics and distribution worldwide and in Portugal. The literature review also highlights important aspects related to the interaction between mollusc, intermediate host and parasitic trematode, and the application of new molecular techniques to the area. With the purpose of reviewing the geographic distribution of these two species of molluscs in continental Portugal, we present results of a malacologic survey of various districts, namely Beja, Coimbra, Évora, Faro, Guarda, Lisboa, Portalegre, Setúbal and Viseu in to Chapter 2. We collected a total of 3219 specimens of P. metidjensis, but no B. truncatus were found. For this reason, the second part of the work used specimens of B. truncatus kept for several generations in the Malacology Laboratory of the Medical Helminthology and Malacology Unit, derived from specimens originally collected by Profª Doutora Maria Amélia Grácio, Director of the Unit. This chapter also characterizes, based on the collected data, the habitats according to physical, natural and bioecological aspects. Chapter 3 focuses on the variability in morphometric characteristics of the shell of P. metidjensis in the different districts, which allowed us to revealed two distinct groups. The first in the regions of Alentejo, Algarve and Estremadura and the second in the regions of the Beiras and Sado. The physical characteristic of the habitats and the collected mollusc’s shells seems to be the factors explaining this similarity. This chapter also refers the population dynamics of four habitats selected for their physical characteristics (two from the district of Évora, two from the district of Faro).Chapter 4 is the study of the molluscs in relation to a possible natural infection by trematodes, as well as their susceptibility to infection by Schistosoma haematobium (strain from Angola) and S. mansoni (strain from Brazil). Out of a total of 3219 specimens of P. metidjensis examined, 1456 (45,2%) eliminated xiphideocercaria. With regard to the susceptibility of P. metidjensis to S. haematobium, the results confirm, once again, the non susceptibility of this species of mollusc to the Angolan strain of S. haematobium. Concerning, S. mansoni, some specimens of P. metidjensis developed infection to the stage of sporocyte, but did not eliminate cercariae. These results did not take place in the mollusc B. truncatus In Chapter 5, we report the first molecular study of P. metidjensis. In this study we used several specimens of P. metidjensis from different habitats, grouped in five districts, to analyse their systematic position and phylogenetic relation with other homologous species, whose sequences were available in GenBank. We used partial sequences of the mitochondrial COI and 16S genes, having found nine haplotypes of COI and four of 16S. These results show a greater number of haplotypes in the Coimbra district, for both genes, implying greater polymorphism in the habitats of this district. Based on the results with the COI and 16S genes, P. metidjensis from Portugal presents a high homology (81%) with other species of Planorbarius spp, as species Biomphalaria spp from the Neotropical and African regions, intermediate hosts of S. mansoni and other trematodes. To evaluate the degree of genetic diversity of P. metidjensis, RAPD markers were collected from molluscs of 19 habitats (out of nine districts). Results suggest not only a hight genetic variability, determined by the Shannon Index (Ho=0, 4981), but also high inter- and intra-populational genetic differentiation (Gst=0,229) (Wright, 1978). The Chapter 6 reports the first molecular characterization of B. truncatus. As referred to earlier, we were not able to collect specimens of this species from the field, having studied lab-maintained populations. The results of this study, with theapplication of RAPD techniques, revealed a high genetic differentiation among populations (Gst=0, 28), as well as a high intrapopulational genetic diversity determined through Shannon’s index (0, 5294 ± 0, 1787), which seems to be related to a low number of migrants. The mitochondrial COI and the ribosomal Internal Transcribed Spacer (ITS) were used for analyzing the systematic position and phylogenetic relation with homologous species (intermediate hosts of Schistosoma spp) whose sequences are available in GenBank. These revealed very high homology with the B. truncatus (Sudan) and B. tropicus (Zambia). Furthermore, a total of seven ITS haplotypes and nine COI haplotypes were identified. The mollusc population of Estói possessed three haplotypes, while the remaining populations presented four distinct haplotypes. The global results for Fst were very low, suggesting a single population. |
