Identification of new regulators of nuclei positioning during skeletal muscle fibers development

Autor: Couturier, Nathalie
Přispěvatelé: Institut NeuroMyoGène (INMG), Université Claude Bernard Lyon 1 (UCBL), Université de Lyon-Université de Lyon-Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)-Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Université de Lyon, Vincent Gache, STAR, ABES
Jazyk: francouzština
Rok vydání: 2020
Předmět:
Zdroj: Biologie cellulaire. Université de Lyon, 2020. Français. ⟨NNT : 2020LYSE1086⟩
Popis: Skeletal muscle fibers are built from fusion of myoblasts allowing the formation of myotubes. Those syncytia contain hundreds of nuclei that undergo many movements, simultaneously with myotubes maturation process, until reaching a final peripheric localization in mature fibers (myofibers). Disorganization of nuclei disposal is always associated with myofibers misfunctioning (i.e.: sarcopenia, centronuclear myopathy). Peripheral nuclei positioning in mature fiber appears to be essential for their functionality. Understanding the process of nuclei positioning turned up as key point. Involvement of molecular motors are known in spacing myonuclei in the first steps of muscle differentiation, however the role of microtubules associated proteins (Maps) is less described. Consequently, identify new Maps involved in nuclei positioning during muscle formation may 1) provide a better understanding of muscle differentiation; 2) bring to light new targets potentially involved in pathologies presenting nuclei mispositioning. In this context, my thesis work consisted in identifying proteins linked to microtubules, directly or indirectly, and involved in the regulation of myonuclei positioning throughout skeletal muscle fibers differentiation. Proteomes associated to microtubules and differentially expressed during muscle differentiation were identified using a mass-spectrometry analysis. Based on this identification, 239 proteins from the total cellular extracts of myotubes and myofibers; and 240 proteins identified in proteomes linked to microtubules were selected. A siRNA screen was performed on primary myotubes in order to decipher the involvement of those selected targets in myonuclei positioning during the first steps of muscle differentiation. This siRNA screen allowed the identification of three proteins which roles on myonuclei positioning appeared to be crucial. Unexpectedly, we identified a cytoplasmic role of the mitotic protein NuMA1 in muscle biology field. This protein progressively accumulates into the cytoplasm where it stabilizes microtubule network in differentiating myofibers. This cytoplasmic fraction of NuMA1 proteins, in association with the dynein, regulates microtubule network architecture and myonuclei spacing. Its role is also crucial in maintaining peripherized myonuclei in mature myofibers and in neuromuscular junction regions. The siRNA screening also highlighted the role of MACF1 protein in maintaining synaptic myonuclei, clustering of acetylcholine receptors, peripherized myonuclei localization and mitochondria organization through a microtubule dynamic regulation in myofibers. Finally, we identified the SH3KBP1 protein as a new regulator of myonuclei positioning related to sarcoplasmic reticulum in the early and latest phases of muscle differentiation
Les fibres musculaires striées squelettiques se forment à partir de cellules musculaires précurseurs, appelées myoblastes. Celles-ci fusionnent entre elles pour permettre la formation d’un syncytium, le myotube. Simultanément à la maturation de ces cellules syncytiales, les centaines de noyaux qui les composent vont subir de nombreux mouvements jusqu’à atteindre leur localisation périphérique caractéristique des fibres musculaires matures (myofibres). Des défauts dans le positionnement des noyaux sont toujours associés à un dysfonctionnement de la fibre musculaire (sarcopénie, myopathie centronucléaire). Le positionnement périphérique des noyaux dans les fibres musculaires matures est apparu comme un élément essentiel à leur fonctionnalité. Étudier les mécanismes sous-jacents aux mouvements de noyaux au cours de la différenciation musculaire s’est ainsi révélé être un aspect primordial à la compréhension de la physiopathologie musculaire. L’implication des moteurs moléculaires dans l’espacement des noyaux au cours des phases précoces de différenciation musculaire est connue. Toutefois, le rôle des protéines associées aux microtubules dans ce processus reste à être étudié. Par conséquent, identifier de nouvelles protéines associées aux microtubules et impliquée dans le positionnement des noyaux au cours du développement musculaire va permettre d’apporter 1) une meilleure compréhension de la différenciation musculaire et 2) de mettre en évidence de nouvelles cibles potentiellement impliquées dans des pathologies présentant un défaut de positionnement nucléaire. Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté en l’identification de protéines associées aux microtubules, directement ou indirectement, et impliquées dans la régulation du positionnement des noyaux au cours de la différenciation des fibres musculaires striées squelettiques. Une approche biochimique, réalisée sur cellules musculaires primaires, couplée à une analyse de spectrométrie de masse ont permis d’identifier les protéomes différentiellement exprimés au cours de la myogenèse. Sur la base de ces résultats, 239 protéines issues des extraits totaux de myotubes et de myofibres ainsi que 240 protéines identifiées dans les protéomes associés aux microtubules ont été sélectionnées. Un criblage ARN interférent utilisant des siRNAs a été réalisé sur myotubes primaires de façon à discriminer l’implication des candidats dans le positionnement des noyaux dans les phases précoces de différenciation musculaire. Le criblage ARN interférent a permis l’identification de trois protéines dont le rôle sur le positionnement des noyaux s’est avéré être essentiel. Nous avons découvert un rôle cytoplasmique de la protéine NuMA1 dans le domaine de la biologie musculaire. Celle-ci s’accumule progressivement dans le cytoplasme où elle stabilise le réseau de microtubules dans les fibres musculaires en développement. Cette fraction cytoplasmique de la protéine NuMA1, en association avec la Dynéine, contrôle l’architecture du réseau microtubulaire et l’espacement des noyaux. Elle est également cruciale pour le maintien des noyaux en position périphérique dans les fibres matures ainsi qu’aux jonctions neuromusculaires. Le criblage ARN interférent a également permis de mettre en exergue le rôle de la protéine MACF1 dans le maintien des noyaux synaptiques, le regroupement des récepteurs à acétylcholine, le positionnement périphérique des noyaux ainsi que l’organisation des mitochondries à travers un contrôle de la dynamique du réseau de microtubules dans les fibres musculaires. Nous avons finalement identifié la protéine SH3KBP1 comme un nouveau régulateur du positionnement des noyaux dans les phases précoces et tardives de différenciation musculaire en association avec le réticulum sarcoplasmique
Databáze: OpenAIRE
Externí odkaz: