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Mestrado de dupla diplomação com a Universidad de Salamanca As plantas, utilizadas pelos seres humanos pelas suas capacidades aromáticas, alimentares e medicinais, são fonte de uma grande diversidade de compostos naturais. Deste modo, e também devido à intensificação da procura de substâncias naturais biologicamente ativas, o interesse da utilização de produtos naturais tem vindo a aumentar substancialmente. Contudo, as plantas têm na sua composição misturas complexas de componentes químicos que apresentam diversas ações biológicas e farmacológicas, pelo que a sua aplicação para fins medicinais carece ainda de muita investigação e experimentação, nomeadamente de ensaios clínicos, que aprovem a sua utilização terapêutica. Ruscus aculeatus L. (família botânica Asparagaceae), é uma espécie utilizada na medicina tradicional, em diversas partes do mundo. As partes aéreas são utilizadas principalmente como diuréticos e a parte subterrânea pode ser utilizada para vários fins, como por exemplo, no tratamento de distúrbios do sistema urinário e como laxante. Na presente dissertação, a parte aérea e, as raízes e rizomas de R. aculeatus L., foram caracterizados quimicamente no que se refere ao conteúdo em compostos fenólicos e propriedades bioativas. Para tal, foram preparados extratos distintos, aquosos (infusões e decocções) e hidroalcoólicos das 2 partes mencionadas da planta. O perfil fenólico de cada extrato foi avaliado por HPLC-DAD-ESI/MS e foram também analisados relativamente às suas bioatividades (atividade antioxidante, citotóxica, anti-inflamatória e antibacteriana). O potencial antioxidante foi avaliado através de dois ensaios celulares distintos: inibição da peroxidação lipídica em tecidos cerebrais de porco (TBARS) e inibição da hemólise oxidativa (OxHILA). As propriedades citotóxicas dos extratos foram avaliadas em quatro linhas celulares tumorais humanas: HeLa (carcionama cervical), NCI H460 (carcinoma de pulmão), MCF-7 (carcinoma da mama) e HepG2 (carcinoma hepatocelular); por sua vez, a citotoxicidade em células não tumorais foi avaliada numa cultura de células não tumorais: PLP2 (cultura primária de células de fígado de porco). A atividade anti-inflamatória foi avaliada utilizando uma linha celular de macrófagos de rato RAW 264.7. A atividade antibacteriana foi avaliada através da técnica de microdiluição, juntamente com o método colorimétrico de deteção rápida com cloreto de p-iodonitrotetrazólio (INT). Através da análise do perfil fenólico dos extratos de R. aculeatus, nove compostos fenólicos foram detetados nos diferentes extratos. O extrato hidroalcoólico da parte aérea apresentou os teores mais elevados em compostos fenólicos, seguido dos extratos aquosos. A apigenina-C-hexósido-C-pentósido isómero II foi o composto maioritário nos extratos aquosos e, no extrato hidroalcoólico foi a quercetina-O-desoxihexósido-hexósido seguida da apigenina-C-hexósido-C-pentósido isómero II. No que diz respeito às bioatividades dos extratos, os resultados apresentaram diferenças significativas consoante o tipo de extrato. No ensaio de TBARS, o extrato hidroalcoólico, foi o que apresentou melhor atividade tanto o da parte aérea como o das raízes e rizomas. No ensaio de OxHILA, os extratos que revelaram melhor atividade para a parte aérea e, para as raízes e rizomas foram a infusão e o hidroalcoólico, respetivamente. Os extratos aquosos da parte aérea e apenas a infusão do extrato de raízes e rizomas, não apresentaram toxicidade em células de fígado de porco saudáveis, enquanto os extratos hidroalcoólicos da parte aérea e raiz e rizoma, bem como a decocção da raiz e rizoma, apresentaram toxicidade contra esta linha celular. O extrato hidroalcoólico da parte aérea foi o que apresentou resultado efetivo na inibição de 50% da produção de óxido nítrico. Nos extratos aquosos, apenas a decocção das raízes e rizoma apresentou atividade anti-inflamatória. No ensaio da avaliação da atividade antibacteriana, a decocção da parte aérea foi efetiva contra a estirpe MRSA – Staphylococcus aureus resistente à meticilina. O presente trabalho permitiu comprovar o potencial biológico associado a esta espécie, em particular às suas bioatividades. Las plantas, utilizadas por los seres humanos por sus fuentes aromáticas, alimentarias y medicinales, son fuente de una gran diversidad de compuestos naturales. Así, y también debido a la demanda intensificada de sustancias naturales biológicamente activas, ha ido en aumento el interés por el uso de productos naturales. Sin embargo, las plantas tienen en su composición mezclas complejas de componentes químicos que tienen diversas acciones biológicas y farmacológicas, por lo que su aplicación con fines medicinales requiere de mucha investigación y experimentación, en concreto ensayos clínicos, que aprueben su uso terapéutico. Ruscus aculeatus L. (familia botánica Asparagaceae), es una planta utilizada en la medicina tradicional, en diferentes partes del mundo. Las partes aéreas se utilizan principalmente como diuréticos y la parte subterránea se puede utilizar para diversos fines, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos del sistema urinario y como laxante. En esta disertación se caracterizó químicamente la parte aérea y las raíces y rizomas de R. aculeatus L. en cuanto al contenido de compuestos fenólicos y propiedades bioactivas. Para ello, se prepararon diferentes extractos acuosos (infusiones y decocciones) e hidroalcohólicos de las dos partes mencionadas de la planta. El perfil fenólico de cada extracto se evaluó mediante HPLC-DAD-ESI / MS y también se analizaron sus bioactividades (actividad antioxidante, citotóxica, antiinflamatoria y antibacteriana). El potencial antioxidante se evaluó a través de dos ensayos celulares diferentes: inhibición de la peroxidación de lípidos en tejidos de cerebro de cerdo (TBARS) e inhibición de hemólisis oxidativa (OxHILA). Las propiedades citotóxicas de los extractos se evaluaron en cuatro líneas de células tumorales humanas: HeLa (carcinoma cervical), NCI H460 (carcinoma de pulmón), MCF-7 (carcinoma de mama) y HepG2 (carcinoma hepatocelular); a su vez, se evaluó la citotoxicidad en células no tumorales en un cultivo de células no tumorales: PLP2 (cultivo primario de células de hígado de cerdo). La actividad antiinflamatoria se evaluó usando una línea celular de macrófagos de ratón RAW 264.7. La actividad antibacteriana se evaluó mediante la técnica de microdilución, junto con el método colorimétrico de detección rápida con cloruro de p-iodonitrotetrazolio (INT). Mediante el análisis del perfil fenólico de extractos de R. aculeatus, se detectaron nueve compuestos fenólicos en los diferentes extractos. El extracto hidroalcohólico de la parte aérea presentó los niveles más altos de compuestos fenólicos, seguido de los extractos acuosos. El isómero II de apigenina-C-hexósido-C-pentosido fue el compuesto principal en los extractos acuosos y, en el extracto hidroalcohólico, estaba la quercetina-O-desoxihexósido-hexósido seguido por el isómero II de apigenina-C-hexósido-C-pentosido. En cuanto a las bioactividades de los extractos, los resultados muestran diferencias significativas según el tipo de extracto. En el ensayo TBARS, el extracto hidroalcohólico fue el que mostró mejor actividad tanto en el extracto de la parte aérea como en el extracto de raíces y rizomas. En la prueba OxHILA, los extractos que mostraron mejor actividad para la parte aérea y para las raíces y rizomas fueron la infusión y el hidroalcohólico, respectivamente. Los extractos acuosos de la parte aérea y solo la infusión del extracto de raíces y rizomas, no presentaron toxicidad en células de hígado de cerdo sanas, mientras que los extractos hidroalcohólicos de la parte aérea y raíz y rizoma, así como la decocción de raíz y rizoma, presentaron toxicidad contra esta línea celular. El extracto hidroalcohólico de la parte aérea fue el que mostró un resultado efectivo al inhibir el 50% de la producción de óxido nítrico. En los extractos acuosos, solo la decocción de las raíces y el rizoma mostró actividad antiinflamatoria. En el ensayo de evaluación de la actividad antibacteriana, la decocción de la parte aérea fue eficaz contra la cepa MRSA - Staphylococcus aureus resistente a meticilina. O presente trabalho permitiu comprovar o potencial biológico associado a esta espécie, em particular às suas bioatividades. Plants, used by humans for their aromatic, food and medicinal properties, are the source of a great diversity of natural compounds. In this way, and also due to the increased demand for biologically active natural substances, the interest in the use of natural products has been increasing substantially. However, plants have in their composition complex mixtures of chemical components that have several biological and pharmacological actions, so their application for medicinal purposes requires a lot of research and experimentation, namely clinical trials, which approve their therapeutic use. Ruscus aculeatus L. (Asparagaceae botanical family), is a plant used in traditional medicine, in different parts of the world. The aerial parts are mainly used as diuretics and the underground part can be used for various purposes, for example, in the treatment of disorders of the urinary system and as laxative. In this dissertation, the aerial part and, the roots and rhizomes of R. aculeatus L., were chemically characterized with regard to the content of phenolic compounds and bioactive properties. For this, different extracts, aqueous (infusions and decoctions) and hydroalcoholic extracts from the two mentioned parts of the plant were prepared. The phenolic profile of each extract was evaluated by HPLC-DAD-ESI / MS and were also analyzed for their bioactivities (antioxidant, cytotoxic, anti-inflammatory and antibacterial activity). The antioxidant potential was evaluated through two different cell assays: inhibition of lipid peroxidation in pig brain tissues (TBARS) and inhibition of oxidative hemolysis (OxHILA). The cytotoxic properties of the extracts were evaluated in four human tumor cell lines: HeLa (cervical carcinoma), NCI H460 (lung carcinoma), MCF-7 (breast carcinoma) and HepG2 (hepatocellular carcinoma); in turn, cytotoxicity in non-tumor cells was evaluated in a non-tumor cell culture: PLP2 (primary culture of pig liver cells). Anti-inflammatory activity was assessed using a RAW 264.7 mouse macrophage cell line. The antibacterial activity was evaluated using the microdilution technique, together with the colorimetric method of rapid detection with p-iodonitrotetrazolium chloride (INT). Through the analysis of the phenolic profile of R. aculeatus extracts, nine phenolic compounds were detected in the different extracts. The hydroalcoholic extract of the aerial part showed the highest levels of phenolic compounds, followed by aqueous extracts. Apigenin-C-hexoside-C-pentoside isomer II was the major compound in aqueous extracts and, in the hydroalcoholic extract was quercetin-O-deoxyhexoside-hexoside followed by apigenin-C-hexoside-C-pentoside isomer II. Regarding the bioactivities of the extracts, the results show significant differences depending on the type of extract. In the TBARS assay, the hydroalcoholic extract was the one that showed the best activity both in the extract of the aerial part and in the extract of roots and rhizomes. In the OxHILA assay, the extracts that showed the best activity for the aerial part and for the roots and rhizomes were the infusion and the hydroalcoholic, respectively. The aqueous extracts of the aerial part and only the infusion of the extract of roots and rhizomes, did not present toxicity in healthy pig liver cells, while the hydroalcoholic extracts of the aerial part and root and rhizome, as well as the decoction of the root and rhizome, presented toxicity against this cell line. The hydroalcoholic extract of the aerial part was the one that showed an effective result in inhibiting 50% of the production of nitric oxide. In aqueous extracts, only the decoction of the roots and rhizome showed anti-inflammatory activity. In the assay of the evaluation of the antibacterial activity, the decoction of the aerial part was effective against the strain MRSA - Staphylococcus aureus methicillin resistant. The present work allowed to prove the biological potential associated with this species, in particular its bioactivities. Este trabalho é financiado pelo programa FEDER-Interreg España-Portugal, no âmbito do projeto 0377_Iberphenol_6_E e TRANSCoLAB 0612_TRANS_CO_LAB_2_P. |
