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2012/2013 My PhD project concerns neurodegenerative processes in the mouse spinal cord, with a particular attention to amyotrophic lateral sclerosis (ALS). During my PhD I have used as a model the organotypic spinal slice cultures and I have focused my studies on: early changes in spinal tissue excitability in an ALS genetic model; spinal network activity changes induced by oxidative stress in wild type (WT) and synaptic activity in premotor circuits when challenged by neuroinflammation in WT. The principal aim of my work was to understand the dialogue between a general stress condition and the spinal premotor network. To this aim, I combined electrophysiological techniques and immunofluorescence analysis to characterized the ventral interneurones located in spinal microcircuits. For that purpose I exploited the organotypic cultures developed from embryonic mouse spinal cord that are generally accepted as a good model to study the neuronal premotor activity and provide high experimental access to interneurones (Avossa et al., 2003). In the first part of my research I compared WT cultures with SOD1G93A transgenic cultures, one of the more investigated ALS model. In cultured spinal networks, as described in acute preparation collected at different stages of development, there is a progressive fastening of glycinergic currents, represented by the reduction of the decay time constant (tau value) of synaptic currents along with the slices growth. WT and SOD1G93A cultures display a different maturation profile since in transgenic slices this developmental process is significantly steeper not only in glycinergic post synaptic currents (PSCs) but also in miniature PSCs (mPSCs). This difference in the glycinergic PSCs kinetic properties can be strongly reduced by the presence of TBOA that lowers the GABA synthesis. These results support the hypothesis that in SOD1G93A cultures there is an increase amount of glycine and GABA co-release leading to the conclusion that the synaptic release is conditioned by the presence of the mutation at an early stage of development, before any evident neuronal degeneration. Moreover, I supported this data also with preliminary results regarding the co-staining of GlyT2 and GAD65 (markers for presynaptic glycine and GABA, respectively). In fact, SOD1G93A spinal organotypic slices seem to display an higher amount of mixed synapses. Next, I tested other stress processes of the tissue that could potentially affect synaptic activity and, ultimately, alter network activity. I tested chronic incubations of the spinal slices, since they are long-term preparations, with stress key players: hydrogen peroxide (H2O2) to create an oxidative stress and lipopolysaccharide (LPS) or a mixture of cytokines (CKs: TNF-α, IL-1β and GM-CSF) to mimic neuroinflammation. For these sets of experiments I have used another strain of mice with no genetic manipulation. All these chronic treatments increase the AMPA receptor mediated PSCs frequency; moreover, a neuroinflammation state is able to enhance the overall network activity; LPS treatment increases also the amplitude of AMPA-mediated synaptic currents in both spontaneous and miniature events, while CKs accelerate the disinhibited burst rhythm induced by the pharmacological removal of the synaptic inhibition that switch on the rhythmogenic centre contained in the spinal network. Summarizing, I detected that the treatments with these environmental cues affected the synaptic component, in this case the excitatory one, of the premotor network. Altogether, my work highlighted that a genetic predisposition (in the case of familial ALS) and environmental factors of different kind (oxidative and inflammatory factors or an alterate SOD1) trigger changes in synaptic transmission and we may speculate that these alterations in the premotor circuit could cooperate in synergy leading to the development of misconnected networks that contribute to induce motoneuronal neurodegeneration. Riassunto Il mio progetto di dottorato riguarda processi neurodegenerativi del midollo spinale, con una particolare attenzione verso la sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Durante il mio dottorato ho usato come modello le fettine organotipiche di midollo spinale e ho concentrato i miei studi su: cambiamenti precoci nell’eccitabilità del tessuto spinale in un modello genetico di SLA; cambiamenti nell’attività del network spinale indotti da stress ossidativo in wild type (WT) e cambiamenti nell’attività sinaptica dei circuiti premotori sottoposti ad uno stress infiammatorio in WT. Il fine principale del mio lavoro era quello di capire il dialogo tra una condizione di stress generale ad il network spinale premotorio. A questo scopo, ho unito tecniche elettrofisiologiche e analisi di immunofluorescenza per caratterizzare gli interneuroni ventrali localizzati nel microcircuito spinale. Per raggiungere questo obiettivo ho sfruttato le colture organotipiche derivate dal midollo spinale di embrioni di topo che sono generalmente accettate come un buon modello per studiare l’attività premotoria neuronale e garantiscono un facile accesso sperimentale agli interneuroni (Avossa et al., 2003). Nella prima parte della mia ricerca ho confrontato colture WT con colture transgeniche SOD1G93A, uno dei modelli di SLA maggiormente studiati. Nei network spinali in coltura, come già descritto in preparazioni acute ottenute a diversi stadi di sviluppo, c’è una progressiva velocizzazione delle correnti glicinergiche, rappresentata dalla riduzione del decay time constant (valore di tau) delle correnti sinaptiche durante la crescita delle fettine. Le colture WT e SOD1G93A presentano un diverso profilo di maturazione dato che nelle colture transgeniche questo processo di sviluppo è significativamente più marcato non solo nelle correnti postsinaptiche (PSCs) ma anche negli eventi in miniatura (mPSCs). Questa differenza nelle proprietà cinetiche delle correnti glicinergiche può essere fortemente ridotta dalla presenza di TBOA che diminuisce la sintesi del GABA. Questi risultati supportano l’ipotesi che nelle colture SOD1G93A ci sia un aumento del co-rilascio GABA/glicina portando alla conclusione che il rilascio sinaptico sia condizionato dalla presenza della mutazione ad uno stadio precoce dello sviluppo, prima di qualsiasi degenerazione neuronale evidente. Inoltre, ho supportato questo dato anche con risultati preliminari riguardanti la marcatura di GlyT2 e GAD65 (due marker per la glicina ed il GABA presinaptici rispettivamente). Infatti, le fettine spinali organotipiche SOD1G93A sembrano caratterizzate da un aumento delle sinapsi miste. Successivamente, ho testato altri processi di stress del tessuto che potrebbero interferire con l’attività sinaptica e, conseguentemente, alterare l’attività del network. Dato che le fettine spinali sono preparazioni a lungo termine, ho testato incubazioni croniche con molecole chiave nei processi di stress: perossido di idrogeno (H2O2) per creare uno stress ossidativo e lipopolisaccaride (LPS) o una miscela di citochine (CKs: TNF-α, IL-1β and GM-CSF) per mimare uno stato infiammatorio. Per questo set di esperimenti ho usato un altro ceppo di topi privo di manipolazione genetica. Tutti questi trattamenti cronici aumentano la frequenza delle correnti mediate dai recettori AMPA; inoltre, uno stato infiammatorio è in grado di incrementare l’attività globale del network; il trattamento con LPS aumenta anche l’ampiezza delle correnti sinaptiche AMPA-mediate, sia spontanee che in miniatura, mentre le CKs accelerano il ritmo dei burst indotto dall’eliminazione farmacologica dell’inibizione sinaptica che accende il centro ritmogenico presente nel network spinale. Riassumendo, ho dimostrato che i trattamenti con questi fattori ambientali alterano la componente sinaptica, in questo caso eccitatoria, del network premotorio. Nel complesso il mio lavoro ha evidenziato che una predisposizione genetica (nel caso della SLA familiare) e fattori ambientali di varia natura (ossidativi, infiammatori o di alterata SOD1) inducono cambiamenti nella trasmissione sinaptica e possiamo speculare sul fatto che queste alterazioni nel circuito premotorio possono cooperare in sinergia causando lo sviluppo di network inefficienti che concorrono a determinare la neurodegenerazione motoneuronale. XXVI Ciclo 1985 |
